Sink-source transition 水稻葉鞘在抽穗期間由儲存組織轉換成供源組織之分子調控機制 研究生 : 陳懷如 指導教授 : 王淑珍副教授 台灣大學農藝學研究所 摘要 水稻上位葉葉鞘為醣類之暫存組織，其在抽穗前會大量累積澱粉，而在抽穗後其儲存之澱粉會快速分解，並合成蔗糖運送到充實中的穀粒，故在抽穗前後期，葉鞘將由儲存組織轉變成供源組織，此現象稱之葉鞘儲存-供源轉換。為了瞭解葉鞘儲存-供源轉換之分子調控機制，本論文以real-time RT-PCR分析在水稻抽穗期間，葉鞘中澱粉合成、澱粉分解與蔗糖轉運蛋白 (sucrose transporter ; OsSUT) 等相關基因之表現變化，結果發現ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 2 (AGP-L2)、granule-bound starch synthase II (GBSSII)、soluble starch synthase I (SSSI)、starch branching enzyme (SBE) I、SBEIII及SBEIV等六個澱粉合成相關基因為影響葉鞘澱粉於抽穗前大量累積之主要基因，且其啟動子共同具有受荷爾蒙調控之序列。另一方面，澱粉分解基因α-amylase2A、β-amylase與蔗糖轉運蛋白基因OsSUT1、4在抽穗後表現量會增高，其很有可能分別參與葉鞘在抽穗後時期，澱粉分解及將蔗糖裝載到韌皮部之過程。進一步利用各種荷爾蒙處理水稻切離葉鞘以探討這些基因受荷爾蒙調控之情形，結果發現ABA會抑制AGPase及GBSS之酵素活性，但是會大量促進α-amylase與β-amylase的活性及OsSUT1及 4的基因表現量，顯示ABA可能為影響葉鞘中醣類代謝反應之因子之一。為了篩選參與水稻葉鞘儲存-供源轉換的調控因子，還藉由基因槍暫時性表現系統，分析OsSUT4基因之不同長度啟動子於抽穗前後的表現，鑑定出一段67 bp之啟動子片段，其可能包含控制OsSUT4基因於抽穗後大量表現之重要cis-acting elements。 背景及研究目標 (6) 植物荷爾蒙ABA對水稻葉鞘中OsSUTs基因表現之影響 收集抽穗前7-10天的切離葉鞘，以ABA處理24小時後，測定水稻蔗糖轉運蛋白: OsSUT1、2及4之基因相對表現量，結果顯示OsSUT1、2及4均受ABA正向調控 。 (7) -2葉葉鞘中ABA含量與澱粉分解酵素活性在抽穗期間的變化 澱粉累積量最高峰在抽穗前3天，抽穗後澱粉快速降解 (a)，而ABA含量從抽穗前3天至抽穗後11天的變化不大，於抽穗後11天開始上升，到了抽穗後18天出現最大量，之後又繼續下降 (b)；葉鞘中-amylase活性僅於抽穗後11天些微上升，於其他時間點並無明顯變化 (c) ；-amylase之活性變化較為顯著，其於抽穗前3天即開始上升，從抽穗後4天到25天都維持在高活性的區域。 a (8) 構築OsSUT4 基因5’端deletion啟動子片段之表現載體 GUS/LUC b (10) EMSA所用DNA探針位置 (10) OsSUT4啟動子片段與葉鞘核蛋白之結合分析 利用EMSA技術探討OsSUT4啟動子片段與葉鞘細胞核蛋白之結合能力，結果顯示DF(-550/-484) 與儲存型葉鞘核蛋白會形成2個DNA-Transcription factor (DNA-TF) 複合物 (S2與S3)，而與供源型葉鞘核蛋白只會形成1個DNA-TF複合物(S3) (a)，而DF(-643/-603)與兩個時期的葉鞘核蛋白均沒有形成DNA-TF複合物 (b)。 (11) OsSUT4啟動子片段與葉鞘核蛋白之結合分析 (9) OsSUT4 啟動子5’-deletion片段活性分析 收集抽穗前5天與抽穗後15天的水稻葉鞘，使用基因槍進行PSUT4-DF (-843/-11)、DF(-643/-11)、DF(-434/-11) 及DF(-248/-11) 之GUS活性分析。(b) 收集抽穗前5天與抽穗後15天的水稻葉鞘，利用基因槍進行PSUT4-DF(-643/-11)、DF(-602/-11)、DF(-550/-11)、DF(-483/-11)、DF(-434/-11)及DF(-248/-11)之啟動子活性分析。 Before heading After heading Leaf sheath Starch granules Sink-source transition 澱粉於抽穗前在上位葉葉鞘中開始累積，而在抽穗之後快速降解，經澱粉分解後所形成之可溶性醣類將轉化形成蔗糖，進一步運移至發育中之穀粒，以做為穀粒充實所需之碳源 。水稻葉鞘在抽穗前後期，由儲藏澱粉的儲存組織 (sink tissue) 轉變成供應醣類的供源組織 (source tissue) 之過程稱為儲存–供源轉變 (sink–source transition)。 為了瞭解水稻葉鞘於抽穗期間儲存–供源轉換的分子調控機制，以下列三種策略進行研究： 利用real-time RT-PCR技術，分析葉鞘中澱粉合成、澱粉分解與蔗糖轉運蛋白相關之各種isogene於 抽穗期間的表現變化，篩選參與水稻葉鞘儲存–供源轉換時期之標識基因。 (2) 藉由荷爾蒙處理水稻切離葉鞘實驗，探討植物荷爾蒙是否可能參與葉鞘中於抽穗期間的醣類代謝調控。 (3) 選擇一個葉鞘儲存-供源轉變的標識基因 (OsSUT4)，藉由其不同長度啟動子片段活性分析，鑑定出調控 此基因於抽穗前後出現差異性表現之啟動子調控區域。 結果 水稻葉鞘於抽穗期間澱粉合成相關基因表現與澱粉含量之相關分析 收集抽穗前20天至抽穗後20天水稻，以real-time RT-PCR偵測澱粉合成相關基因之mRNA表現量後，與同時間點之澱粉含量進行相關性分析，結果顯示AGP-L2、 GBSSII、 SSSI、 SBEI、 SBEIII與SBEIV等基因表現與澱粉含量呈現高度相關性。 a r 代表基因轉錄表現量和澱粉含量的相關係數。 * 及 ** 分別表示顯著相關p < 0.05 與 p < 0.01。 ADP-glucose pyrophosphorylase Starch synthase Branching enzyme and debranching enzyme Gene ra AGP-L1 -0.27 GBSSII 0.88** SBEI 0.84** AGP-L2 SSSI 0.69* SBEIII 0.86** AGP-S1 0.53 SSSII-1 0.23 SBEIV 0.81** AGP-S2 0.44 SSSII-2 0.52 DBE 0.06 SSSIII 0.34 SSSIV-1 -0.06 SSSIV-2 -0.44 (2)葉鞘中澱粉分解相關基因於抽穗期間之表現 以real-time RT-PCR方式偵測-2葉葉鞘中α-amylase 1A、2A、3E及β-amylase於抽穗期間之表現 ，結果顯示α-amylase 2A與β-amylase在抽穗後表現量增加。 (3)葉鞘中蔗糖轉運蛋白基因於抽穗期間之表現 以real-time RT-PCR方式偵測-2葉葉鞘中蔗糖轉運蛋白基因 (OsSUTs) 於抽穗期間之表現 ，結果顯示OsSUT1與OsSUT4在抽穗後表現量增加。 a b (4) 植物荷爾蒙對水稻葉鞘澱粉含量之影響 偵測儲存期 (a) 與供源期 (b)葉鞘在GA、ABA與BAP荷爾蒙處理24小時下的澱粉含量，結果顯示ABA會降低澱粉含量，而BAP會提升葉鞘中澱粉含量。 (5) ABA對水稻葉鞘中澱粉代謝相關酵素之影響 收集抽穗前7-10天的切離葉鞘，以ABA處理24小時後，測定澱粉合成相關酵素: AGPase (a)、SBE (b)、GBSS (c)、SSS (d) 與澱粉分解相關酵素: α-amylase (e)、β-amylase (f) 之活性，結果顯示ABA會使AGPase與GBSS的酵素活性降低，而提高α-amylase及β-amylase酵素活性。 Starch accumulation Starch degradation Sucrose transfer After heading -amylase -amylase ABA OsSUT1 OsSUT4 AGPase GBSS X Starch synthesis AGP-L2、GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII、SBEIV -amylase 2A、-amylase Sucrose transport OsSUT1、OsSUT4 (1) AGP-L2、GBSSII、SSSI、SBEI、SBEIII、SBEIV、 α-amylase2A與 β-amylase為-2葉鞘在儲存-供源轉換期間與澱粉代謝相關之主要標識基因。蔗糖轉運蛋白OsSUT1、OsSUT4可能於供源時期的葉鞘中，負責運輸醣類到需要的儲藏組織中。 結論 (2) 抽穗後葉鞘ABA含量增加，促進澱粉分解酵素的活性與蔗糖轉運蛋白基因表現，並抑制AGPase與GBSS酵素之活性，其扮演影響葉鞘中醣類代謝之調控因子的角色 。