思考题（课前设疑） 1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？ 2.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？ 3.在制备生化物质前应如何选择原料？

4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？ 5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？ 6.以细丙为例解释提取制备每步的基本原理？

生 化 物 质 的 制 备

一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段： 1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎； 3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品 的工艺过程； 4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；

5.干燥及保存； 6.成品及.制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。 利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题：

1．生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。

2．在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有1／l0 000，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比“虎头蛇尾”。近年来，用所谓“钓鱼法”，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的优越性。

3．许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保护这些化合物生物的活性，常选择 十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中，过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体内自身酶的作用，均可破坏这些分子的结构或生理活性。

4．生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、pH、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常无法固定，有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。因此，要建立重复性好的成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。

5．生化制备方法最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对“均一性”结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。

原料选择和预处理 选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几个方面: 4．成本比较低； 5．经济效果要好。 1．要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．成本比较低； 5．经济效果要好。

如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。

对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。

1．种属 牛胰含胰岛素（isulin)单位比猪胰高，牛为4000 IU／kg胰脏，猪为3000 IU／kg胰脏。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。

2．发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。

3．生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO（erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。

4．原料来源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。

5．原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶(pepsin)则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。

6.从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。

7．对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；用枯草杆菌

或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。

原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，

常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。

一、机械法 主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（10 000r／min）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。

二、物理法 1.反复冻融法 把待破碎的样品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。

2.冷热交替法 在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

3．超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50～100mg／L菌体的浓度，在1KHz～10KHz（千赫兹）频率下处理10～15min。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。

20.59～34.32（兆帕）MPa（210～350kgf／cm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。 4.压破碎法 加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达 20.59～34.32（兆帕）MPa（210～350kgf／cm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。

三、生化及化学法 1．自溶法 即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料选在0～4℃，微生物材料则多在室温下进行。

自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。

2．酶处理法 用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8的0.1mol／L三羟甲基氨基甲烷（Tris）－0.01mol／L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液，

然后加入100μg～ 1mg的溶菌酶，在37℃保温10min，细菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶用于酵母细胞的破碎；用胰酶处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。

3.表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

生化物质的提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extraction），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍（maceration）；用热溶剂者可称为浸提（digestion），也称浸煮

一、物质的性质与提取 （一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。 （二）活性物质的保护措施 1．采用缓冲系统 2．添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等） 3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)

（三）生化物质的提取 4．其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌 ） 一般生产上多用2～3次提取。溶剂用量（L）为生物材料的2～5倍，少数情况也有用10～20倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。

二、影响提取的因素 （－）温度 （二）酸碱度 （三）盐浓度

四、提取方法 （—）用酸、碱、盐水溶液提取 （二）用表面活性剂提取 （三）有机溶剂提取

对酸性物质的提取，常在碱性条件下进行；对碱性物质的提取，常在酸性条件下进行；对两性物质的提取，则使水溶液的pH值在该两性物质的等电点附近为佳。

细胞色素C 的制备与测定

细胞色素C的性质 细胞色素（Cytochrome）是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，广泛存在于自然界，在各种动物，植物组织和微生物中都能找到。在生物氧化过程中，细胞色素是重要的呼吸传递体。细胞色素C（Cytochrome C）又称细胞色素丙，

简称细丙。主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。所以制备中多采用心肌和酵母作为提取分离细胞色素C的原料。

细胞色素C是含铁卟啉的结合蛋白质。铁卟啉和蛋白质部分的比例为1:1。由碳、氢、氧、氮、硫、铁6种元素组成。牛、马、猪、人心的细胞色素C蛋白质部分均由104个氨基酸组成，其中只有数个氨基酸不同，氨基酸中含有较多

的精氨酸，故呈盐基性。猪心肌的细胞色素C含铁量为0. 38～ 0. 43％，相对分子质量12200，等电点pI为10. 2～10 的精氨酸，故呈盐基性。猪心肌的细胞色素C含铁量为0.38～ 0.43％，相对分子质量12200，等电点pI为10.2～10.8。细胞色素C的结构中的辅基通过卟啉环上乙烯基的α-碳和酶蛋白的一SH基按1:1连接成硫醚键，其连接方式见下图。

图 细胞色素C的结构式

细胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它可分为氧化型和还原型两种。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应。 R 一Fe3+ R－Fe2+ 氧化型细胞色素C 还原型细胞色素C

这里R代表细胞色素C分子中铁原子以外的卟啉蛋白部分。从以上反应式可见，当细胞色素C分子中的铁原子为三价时(Fe3十)，是氧化型的，但接受一个电子后变成二价铁（Fe2+），成了还原型的细胞色素c分子，电子一旦给出后又成了氧化型的。两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。

细胞色素C对热较稳定，不易变性，在pH 7. 2～10. 2时，加热至100℃ 3min，变性才18～28%。对酸碱比较稳定，可抵抗0 细胞色素C对热较稳定，不易变性，在pH 7.2～10.2时，加热至100℃ 3min，变性才18～28%。对酸碱比较稳定，可抵抗0.3mol／L HCl和0.1mol/L KOH的长时间处理。但三氯醋酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。

其还原型较氧化型稳定，不易与一氧化碳（CO）、氰化钾（KCN）结合，故一般都制成还原型，比较稳定，易保存细胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低温保存，亦可保存于硫酸铵溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成冻干粉末，可保持活性数年。

细胞色素C的临床作用 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细胞恢复正常呼吸，病情得到缓解

或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。

如用细胞色素C治疗脑血管障碍、脑软化、脑出血、中风后遗症、脑动脉硬化症、脑外伤、婴幼儿百日咳、脑病、不可逆休克期缺氧、脑栓塞、脑震荡后遗症、乙型脑炎的神经精神症状、心代偿不全、心肌炎、狭心症、白喉心肌炎、肺心病、心绞痛、

心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺气肿及支气管扩张引起的呼吸困难、一氧化碳中毒、安眠药中毒、麻醉前处理、新生儿假死、神经麻痹症等。对抗癌药物引起的白血球降低、四肢血行障碍、肝疾患、肾炎等亦有一定疗效。

细胞色素C(Cyt.C)的制备及含量测定 每组称心肌碎肉150g，加自来水300mL（水预先用6～7mL 1mol/L H2SO4 酸化）  用1mol/L H2SO4调pH3.8～ 4.0（需不断调整）  搅拌提取1.5h  用1mol/L NH4OH调pH6.0 用四层纱布挤压过滤，收集滤液（暗紫色，浑浊），肉渣回收  用1mol/L NH4OH调pH7.5～ 8.0，静置10～30min，使溶液分层 虹吸上部溶液，过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm，15min）   

 每人称人造沸石4g 合并清液  浮选 平均分成两份 自来水装柱   上样（流速不大于10mL/min） Cyt.C吸附，沸石呈红色，流出液为黄色（或浅红色）  依次用30mL自来水、去离子水、  0.2% NaCl、去离子水洗柱 用25% (NH4)2SO4洗脱（流速小于2mL/min）

 收集红色洗脱液，量体积（控制在10mL左右） 每100mL洗脱液加17g固体(NH4)2SO4，边加边搅拌至(NH4)2SO4完全溶解，并有沉淀析出 将溶液置于小试剂瓶中，室温静置一周 （接上周） 滤纸过滤，收集滤液，量体积  按8% 体积滴加20% TCA，边加边搅拌 Cyt.C形成可逆沉淀，立即离心（3000rpm，15min），收集 沉淀

若上清液仍为红色，倒出后再补加5% 体积的TCA，再次离心，收集沉淀  Cyt.C沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过5mL）  溶解液装入透析袋 对自来水、去离子水透析，用Ba(Ac)2检测透析袋周围水的SO42- 过滤除去不溶物,得到Cyt.C粗品液，量体积，测定其含量

取5支试管，按以下步骤操作： 试管编号 1 2 3 4 5 标准液/mL 0.5 样品液/mL 0.5 dH2O/mL 3.0 2.5   取5支试管，按以下步骤操作： 试管编号 1 2 3 4 5 标准液/mL 0.5 样品液/mL 0.5 dH2O/mL 3.0 2.5 还原粉 少许 A520nm   注明：依样品液颜色深浅适当增减所取样品液的体积，用dH2O补足4mL，使样品管与标准管颜色相近，以减少误差。

总含量＝χ× 稀释倍数×总体积 计算总含量（75g心肌） 分别取2号与3号管A的平均值和4号与5号管A的平均值，并都减去1号空白管的A值，然后按以下公式计算。 标准管A520nm值：标准含量＝样品管A520nm值：χ 标准含量×样品A520nm值 χ= 标准A520nm值 总含量＝χ× 稀释倍数×总体积