第25章 病毒感染的检查方法与防治原则

病毒感染的检查方法 病毒的病原学诊断 检查方法 病毒的血清学诊断

病程阶段 可检测到病毒 可检测到特异性抗体 潜伏期 少 无 前驱症状 有时 发病 经常 急性期 恢复期

（一）标本采集与送检 用于病毒分离标本采集原则 越早越好（急性期） 冷藏不冷冻 病毒输送培养基（50%甘油等） 注意无菌操作，可加抗生素 用于血清学诊断标本采集 有 诊断价值 双份血清标本，效价大于4倍 单份血清，IgM型抗体 （储存温度< -20℃）

（二）分离培养与鉴定 动物接种: 小白鼠、豚鼠 狗、猫、猴等 不同病毒 不同动物 不同部位 鸡胚接种： 绒毛尿囊膜 尿囊 卵黄囊 羊膜腔 不同病毒 不同胚龄 不同部位

The embryonated hen’s egg

鸡胚接种 羊膜腔 卵黄囊 尿囊 绒毛尿囊膜 动物接种

细胞培养

原代细胞培养 将组织经酶消化成单个细胞后培养， 在培养瓶底部长成单层细胞 特点：正常细胞，均为二倍染色体 对病毒敏感性高 可用于生产病毒疫苗 但不能持续传代培养，故不便用于诊断 种类：人胚肾、猴肾、鸡胚等

二倍体细胞培养 将组织经酶消化成单个细胞后培养， 在培养瓶底部长成单层细胞 特点：生长迅速，能传50代左右， 仍保持二倍染色体 可用于生产病毒疫苗和实验室诊断 种类：人胚肺、恒河猴胚细胞等

传代细胞培养 有肿瘤细胞或二倍体细胞突变而来， 有贴壁单层细胞与悬浮细胞二种 特点：生长迅速，可无限传代， 但染色体常异常，不是二倍体 有肿瘤细胞特性 用于科研、实验室诊断等 种类：Hela细胞、Vero细胞、HEp-2细胞等

EBV感染的B淋巴细胞能在体外持续传代 T淋巴细胞体外培养——加入T细胞生长因子 淋巴细胞培养 EBV感染的B淋巴细胞能在体外持续传代 T淋巴细胞体外培养——加入T细胞生长因子

病毒感染的指标 动物接种---动物发病 鸡胚接种---鸡胚死亡或出现病变 组织培养---细胞病变（团缩、裂解、肿大等）

病毒在细胞（组织）内增殖的指标 细胞变化 红细胞吸附 干扰现象 培养液pH改变 CPE (Cytopathic effect, CPE) 包涵体（Inclusion Body） 红细胞吸附 干扰现象 培养液pH改变

Cytopathic effect, CPE (细胞病变效应) 病毒在细胞内增殖的指标 Cytopathic effect, CPE (细胞病变效应) 正常细胞 病变细胞

epithelial cells - adenovirus uninfected early infection late infection

空斑形成单位 plaque-forming units 病毒定量指标 空斑形成单位 plaque-forming units 半数细胞病变量 50% Tissue culture dose (TCD50) 半数致死量 50%Lethal dose (LD50) 半数感染量 50% Infectious dose (ID50)

PLAQUE ASSAY

PLAQUE ASSAY

PLAQUE ASSAY

Diluted 10 fold Diluted 100 fold Diluted 1000 fold

形态学检查法 光学显微镜 病毒包涵体 融合细胞 电子显微镜 透射、扫描 免疫电子显微镜

包涵体形成 狂犬病毒包涵体（Negri body）

巨 细 胞 病 毒 包 涵 体

抗原的检测 免疫荧光法： 用荧光标记抗体测定样品中的病毒抗原 酶联免疫吸附试验： 用酶标记抗体测定样品中的病毒抗原 Sputum sample Y

Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen.

ELISA for HIV antibody Microplate ELISA for HIV antibody: colored wells indicate reactivity

抗体的检出 中和试验 有无病变 细胞 (病毒+病人血清) 动物 有无发病 有病变阴性，无病变阳性 特异性高，维持时间长，常用

+ 血凝抑制试验 (含血凝素病毒 + 病人血清) 红细胞 红细胞凝集----阴性 红细胞不凝集--血凝抑制--阳性 补体结合试验 (病毒抗原+病人血清) + 补体 + (红细胞+溶血素) 溶血-----阴性 不溶血---阳性

检测病毒的核酸 1、核酸杂交技术 斑点杂交 dot blot hybridization 原位杂交 in site hybridization DNA印迹 Southern blot RNA印迹 Northern blot 2、聚合酶联反应 3、DNA芯片技术

Southern blot PCR

Virus RSV Rhino HMPV Total PCR Positive 38 29 32 11 110 12 (32%) 17 Comparison of cell culture with PCR for Influenza A and B and RSV-200 specimen tested winter 2006/07-Sheffield Virus RSV Flu A Rhino HMPV Total PCR Positive 38 29 32 11 110 Cell Culture 12 (32%) 17 (59%) 1 (3%) 0 30 (27%) Total

二、病毒感染的免疫预防 免疫 预防 同细菌感染，通过人工接种生物制剂的方法达到预防、控制和消灭传染病的目的。 人工主动免疫：减毒活疫苗、灭活疫苗、 基因工程疫苗、核酸疫苗 人工被动免疫：普通免疫球蛋白 抗病毒血清（高特异性免疫球蛋白 ） 免疫调节剂

How vaccines work Taken from: http://www.mayoclinic.com/health/vaccines/ID00023 Vaccine stimulates your immune system to produce antibodies against the viral proteins, so that any exposure following the vaccination will be met with infection-specific resistance.

人工主动免疫 灭活疫苗和减毒活疫苗 灭活疫苗 减毒活疫苗 产生途径 甲醛灭活 筛选毒力变异株 免疫持续时间 较短 较长 保护力 较低 较高 免疫球蛋白产生 IgG IgA和IgG 黏膜免疫产生 低 有 细胞介导免疫产生 毒力回复 无 可能 疫苗运输和使用中的扩散 受宿主其它病毒干扰 室温稳定性 高

我国常用病毒疫苗 疫苗名称 种类 备注 脊髓灰质炎疫苗 减毒活疫苗 麻疹疫苗 腮腺炎疫苗 风疹疫苗 甲型肝炎疫苗 乙型肝炎疫苗 基因工程疫苗 酵母菌表达 乙型脑炎疫苗 灭活疫苗 也有减毒活疫苗 人用狂犬病疫苗

抗病毒治疗 特点 1、迄今未有一个理想的，特效的抗病毒药物 2、主要是通过抑制病毒复制和提高机体的免 疫力来进行抗病毒治疗 种类 1、化学治疗：抑制病毒复制的化学药物 2、免疫治疗：免疫调节剂、抗体、淋巴因子 3、基因治疗：导入基因于人体细胞，表达抗 病毒物质

抑制病毒穿入、黏附、脱壳、释放：金刚烷胺类药物 化学治疗 抑制病毒穿入、黏附、脱壳、释放：金刚烷胺类药物 抑制病毒生物合成：核苷类和非核苷类药物 吸附和穿入 脱壳 生物合成 生物合成 释放 装配 宿主细胞膜 宿主细胞核膜

常见抗病毒药 核苷类药物(无环鸟苷等) 干扰病毒的核酸合成 非核苷类药物 (奈韦拉平等) 抑制逆转录酶 病毒蛋白酶抑制物 (英迪那韦等) 抑制蛋白酶 其他抗病毒药物(金刚烷胺等) 阻止病毒包膜与溶酶体的融合，阻止病毒脱壳 干扰素 中草药

阿昔洛韦、阿糖胞苷、膦甲酸和羟甲基无环鸟苷抑制单纯疱疹病毒复制的机理

脱壳：金刚烷胺；抑制RNA复制：利巴韦林；抑制细胞间扩散：达菲 流感病毒 脱壳：金刚烷胺；抑制RNA复制：利巴韦林；抑制细胞间扩散：达菲

AZT/ZDV 叠氮脱氧胸苷

抑制病毒蛋白的修饰 病毒蛋白酶抑制物 使病毒前体蛋白多聚体不被酶解，使得感染细胞只能产生非感染性病毒颗粒，阻止病毒在细胞间传播

以抗HIV药物为例 抗病毒治疗： 核苷类逆转录酶抑制剂 非核苷类逆转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 联合疗法

治疗：鸡尾酒疗法（HAART） 联合交替使用2种HIV逆转酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂（Saquinavir、Ritonavir）可有效将血液中HIV含量降到最低，极大延长感染者寿命 无法清除整合的病毒，不能彻底清除病毒 药物有副作用 在中国年均费用8万 RMB

逆转录酶抑制剂

免疫治疗 慢性感染病人免疫细胞功能低下或异常 对自体免疫细胞进行体外修饰，提高其功能