出凝血筛选试验及其临床应用 北京协和医院检验科 苏薇

Stable Hemostatic Plug Hemostasis: BV Injury Tissue Factor Neural ET vWF FN Coagulation Activation Blood Vessel Constriction Platelet Activation Primary hemostatic plug Reduced Blood flow Plt-Fusion Thrombin, Fibrin Stable Hemostatic Plug

血管内出凝血的动态平衡 血管 血小板 凝血因子 纤溶系统/抑制物

平衡的打破 血管 出血 血栓 血小板 凝血因子 纤溶系统/抑制物

常规出凝血试验 凝血因子 PT – 外源性凝血因子 APTT – 内源性凝血因子 纤维蛋白原 血小板 血小板计数 血小板聚集试验 出血时间试验 纤溶/抑制物 凝血酶时间（TT），D-二聚体，纤维蛋白（原） 降解产物（FDP） 特殊测定 AT-III, 蛋白 C, 蛋白 S

外源性凝血因子筛选试验：PT

VII VIIa X Xa II Va IIa V XIII XIIIa 外源性凝血途径(PT) 共同途径 纤维蛋白原 纤维蛋白 多聚体 组织因子 纤维蛋白凝块 + 血小板血栓

凝血酶原时间 组织因子+Ca2+ 病人标本 Factors I II V VII X

PT的临床应用 评估外源性凝血因子缺陷 易栓症、血栓前状态和脑、肺等静脉血栓的预防 遗传性或先天性因子缺乏：VII因子（正常血浆可纠正），II因子（正常血浆不可纠正） 获得性因子缺乏 肝脏疾病 维生素K缺乏 口服抗凝剂治疗 易栓症、血栓前状态和脑、肺等静脉血栓的预防

外源性凝血因子活性测定 因子II, V, VII, X F.VII活性为0% PT延长 加入不同浓度的因子VII 标准物 PT被纠正 纠正程度与F.VII 浓度呈正比 0.1 mL F.VII 缺乏血浆 0.1 mL F.VII 标准或病人稀释血浆 0.2 mL凝血活酶 和钙的混合物

标准曲线 稀释度 % 活动度 凝固时间 1:5 20.0% 14.3 seconds 1:10 10.0% 17.3 seconds 30 25 20 15 10 5 2 5 10 20

病例一 患者73岁，男性，脑血栓，2008年2月开始进行华法令治疗。PT-INR为3.0左右，无出血倾向。2008年9月24日，突然动作迟钝，向右侧瘫倒，神经内科通过CT、脑血管造影检查发现脑血栓复发，而后使用肝素治疗。 实验室进一步测定可溶性纤维蛋白单体复合物和D－二聚体。

本例启示 PT-INR反映华法令治疗后凝血因子活性和含量降低的程度，但不反映其他抗凝物质（如蛋白C）的活性，更不能反映血管壁和血流的异常。 PT-INR升高至3.21，不代表不会发生血栓。可以用SFMC、D-二聚体等作为血栓形成的指标。

内源性凝血因子筛选试验：APTT

内源性凝血 途径 (aPTT) 共同途径 X IX XI XII XIIa XIa IXa VIIIa Xa VIII II Va V Fibrinogen Kinins X IX XI XII HMWK Prekalli- krein Kalli- XIIa XIa IXa VIIIa Xa 内源性凝血 途径 (aPTT) VIII 共同途径 II Va V IIa XIII XIIIa Fibrin Polymer Fibrin Clot + Platelet Plug

活化的部分凝血活酶时间 Ca++ 病人标本 Factors I II V VIII IX X XI XII 磷脂和激活剂

APTT的临床应用 评估内源凝血因子缺陷 监测肝素 遗传性或先天性凝血因子缺陷：VIII、IX、XI因子缺乏（血友病A、B、C），II、V、X、XII因子缺乏。 获得性凝血因子缺乏：肝脏疾病 复合性凝血因子缺乏：DIC 获得性抗凝物质：狼疮抗凝物质、VIII因子抗体、其他如IX、XI、V、X抗体等、肝素样抗凝物质。 监测肝素

AT-III对凝血酶的抑制作用 凝血酶, AT-III 和肝素 凝血酶的灭活 赖氨酸位点 肝素 丝氨酸位点 AT-III 酸性位点 凝血酶 无活性 酸性位点 凝血酶 (有活性) 精氨酸位点 肝素 凝血酶的灭活 AT-III复合物 被抑制的凝血酶 AT-III肝素凝血酶复合物

肝素/AT-III 复合物

获得性抑制物 1. 狼疮抗凝物：抗磷脂抗体，具有结合磷脂的能力，使体外实验如APTT凝血时间延长，临床表现为静脉血栓、反复流产，可继发于自身免疫性疾病、感染、癌症、炎症、药物等。 2. VIII因子抑制物：抑制因子VIII活性，临床表现与血友病A相同，但可发生于女性，初次出血可发生于老龄期。

获得性抑制物 VIII 狼疮 抑制物 抗凝物质 APTT 延长 延长 PT 正常 延长或正常 APTT: 延长, 延长, 抑制物 抗凝物质 APTT 延长 延长 PT 正常 延长或正常 APTT: 延长, 延长, 与正常血浆 与孵育时间相关 与孵育时间不相关 1:1混合 其他特性 因子 XII, XI, IX 和 VIII活性测定结果受 稀释倍数的影响

内源性凝血因子活性测定 因子 VIII, IX, XI, XII 加入不同F.VIII浓度的标准，APTT缩短 0.1 mL 乏因子VIII 血浆 F.VIII活性0%血浆 APTT延长 纠正程度与F.VIII 浓度呈正比 0.1 mL F.VIII标准 或病人稀释血浆 0.1 mL 磷脂和激活剂 0.1 mL CaCL2

病例二 患者72岁，女性。主诉皮下出血，57岁时被诊断为高血压、高血脂症，69岁时因脑梗塞而引起左侧瘫痪。入院进行脑梗塞的康复治疗。其间，突然出现皮下出血，3天后出现全身明显的皮下出血。 凝血测定显示，PT活动度为84％，APTT明显延长，高达142.9秒，凝血因子活性VIII:C<5%;IX:C 88%; XI:C 101%; XII:C 85%

问题讨论 应该作何诊断：血友病？但该患者高龄发病，且为女性。 应该继续进行何种检查呢？

本例启示 正常血浆纠正实验显示，该病人可能含有VIII因子抗体，需要测定VIII因子抑制物加以确定。 正常血浆纠正实验可用于鉴别凝血因子缺乏和凝血因子抑制物。

纤维蛋白原定量 Clauss法

纤维蛋白原定量 高浓度凝血酶 1:10 稀释病人标本 Fibrinogen in mg/dL Time (in seconds) 20 40 60 100 200 400 600 30 10 6 3 1:40 1:30 1:20 1:10 1:5

Fbg的临床应用 评估肝脏的合成功能 DIC/原纤诊断 急性时相蛋白和肿瘤生长转移的标志 动脉血栓独立危险因素

凝血酶时间：TT

凝血酶时间 低浓度凝血酶 未经稀释的病人标本 肝素和FDP 的筛选

TT的临床应用 DIC诊断 评估异常抗凝物质：如类肝素物质 异常纤维蛋白原的筛选试验

血管 血小板 凝血因子 纤溶系统/抑制物

血小板激活 激活位点 PAR位点:Thrombin与其受体结合的位点 ADP位点 TXA2位点 花生四烯酸激活通路 37 37 Agonist Activation Platelets can be activated by agonists. An agonist is a chemical messenger that binds to an activation site (for example, a receptor) on a cell, altering the cell’s activity. Many platelet agonists react with specific platelet activation sites, ultimately leading to the expression of the GPIIb/IIIa receptors on the platelet’s surface. For example, the ADP agonist activates ADP receptor sites on the platelet. This leads to the expression of the GPIIb/IIIa receptors on the surface of the platelet, enabling the platelet to bind to fibrinogen. Platelet agonists will either react directly with an activation site or facilitate a pathway that produces an agonist that reacts with an activation site. Platelet agonists include thrombin, ADP, thromboxane A2, prostacyclin, prostaglandin, platelet activating factor, epinephrine, and serotonin. Platelet agonists involved in the PlateletMapping assay include: Thrombin ADP AA (acts as a substrate for Thromboxane A2(TxA2) generation) Thrombin, the most potent platelet activator, activates the protease activated receptor (PAR) activation sites on the platelet surface. This, in turn, leads to expression of GPIIb/IIIa receptors. The ADP agonist reacts with the ADP activation sites, leading to expression of GPIIb/IIIa receptors. Platelets use arachidonic acid to produce thromboxane A2 (TxA2) and then release it. TxA2 activates TxA2 receptors on platelets which leads to the expression of GPIIb/IIIa sites. Because platelet function significantly affects clot formation and clot strength, controlling platelet activation helps to control clot formation. Strategies include drugs that inhibit: 􀁺 Thrombin generation 􀁺 GPIIb/IIIa receptor sites 􀁺 Activation sites and pathways 37 37

血小板聚集 活化血小板膜GPIIb/IIIa暴露出纤维蛋白原受体 纤维蛋白原与多个GPIIb/IIIa 结合，造成血小板聚集 When a platelet is activated, the Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) receptors are expressed on the platelet’s surface. These receptors allow fibrinogen to bind to the platelets resulting in platelet aggregation. 38 38

LTA测定原理 富血小板血浆 乏血小板血浆 二级反应（释放作用） 初级反应 延迟 进样点 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 二级反应（释放作用） 初级反应 延迟 进样点

血管 血小板 凝血因子 纤溶系统/抑制物

纤溶 激活剂 纤溶酶原 纤溶酶 纤维蛋白原 纤维蛋白 降解产物 R.E.S.

纤维蛋白溶解系统 D-二聚体 纤维 蛋白原 纤维蛋白 单体 交联 纤维蛋白 纤溶 酶 极附属物 多聚体，复合物 Bβ1-42 X,Y,D,E 凝血酶 FPA, FPB ⅩⅢa 纤维 蛋白原 纤维蛋白 单体 交联 纤维蛋白 纤溶 酶 极附属物 多聚体，复合物 Bβ1-42 X,Y,D,E Bβ15-24 X,,Y,,D,E, D-二聚体 FDP

FDP ↑ FDP ↑, D-二聚体↑ 原发性纤溶亢进： 继发性纤溶亢进： 凝血瀑布没有形成，无凝血酶生成，纤溶酶活性↑，导致纤溶亢进，纤维蛋白原被降解； FDP ↑ 继发性纤溶亢进： 继发于凝血酶生成后，有纤维蛋白单体生成及交联的纤维蛋白形成，而后发生的纤溶。 FDP ↑, D-二聚体↑

纤溶活性判断 FDP（-）和DD（-）： 若是定量分析则纤溶活性偏低，见于血栓性疾病。 FDP（+）和DD（+）：纤溶活性亢进，见于DIC、溶栓治疗。 FDP（+）和DD（-）：视定量分析结果而定，见于肝病，具有一定纤溶活性的健康人，原发性纤溶活性亢进等。 FDP（-）和DD（+）：FDP假阴性，DD假阳性。

D Dimer定量测定 1.DIC 诊断指标 2.肺栓塞（PE）和深静脉血栓（DVT）的排除

DIC的检测与诊断 1．血涂片检查 DIC时，50%的病人外周血涂片可发现碎红细胞增高，通常>3%，但其百分率与DIC严重程度无相关性。 2．血小板计数 DIC时，一般为50～100×109/L；处于代偿时，可大于100×109/L，但不会超过150×109/L；在革兰氏阴性细菌所致DIC，Plt早期就可明显下降；革兰氏阳性菌败血症和其它疾病引起的DIC，Plt和Fg往往同步下降。 3．血浆纤维蛋白原含量 DIC明显降低，一般小于1.5g/L，或呈进行性下降（由于部分病人基础Fg含量较高）。亦有少数因代偿过度而>4g/L。

4．血浆凝血酶原时间、活化的部分凝血活酶时间和凝血酶时间测定 DIC时均可延长，但DIC早期和慢性DIC时可以正常范围。 5．血浆D二聚体检测 在DIC时为阳性，但肝病时定性检测有部分假阳性。定量检测是最可靠的特异性指标，通常DIC时的值可超过参考值上限的4倍。 6．血浆FDP测定 DIC时明显高于正常值，一般大于40mg/L。本试验被认为是DIC诊断中最敏感的指标之一，已被建议与 D二聚体检测同时进行。

病例一 患者胡××，女，42岁。因肺部阴影、肺间质病变入院检查。

该病人第二天采用非稀释测定模式测定D－二聚体浓度为4.27mg/L（Sysmex CA7000）和3.96mg/L（Beckman Top）

问题讨论 哪个结果是正确的？ 样品稀释情况不同，为什么会出现完全不同的结果？

抗原过量造成的后带现象

病例二 外院病人，淋巴瘤，单克隆免疫球蛋白（M蛋白）血症，IgM 9.1g/L(参考值0.4-2.3g/L），类风湿因子阴性。D-dimer经多次稀释才得到测定值为200000mg/L（Beckman TOP),与临床表现不符，遂将该病人标本拿到本院测定。本院Sysmex INNOVANCE系统测定结果为0.79mg/L。

存在干扰测定的因素 一般情况下，当测定被干扰时，采用连续稀释样品的方式排除干扰物的影响。当稀释至某一倍数时，干扰物的影响最小。 本例可能为大分子免疫球蛋白对Beckman试剂产生了干扰，而对INNOVANCE试剂没有干扰。

病例三 患者许×，男，29岁，POEMS综合症。入院治疗检查凝血功能。

样品存在微细凝块 该病人的凝血和纤溶系统功能应为正常，出现异常结果的原因可能为标本留取不当，出现了肉眼不易观察到的微细凝块，纤溶系统激活导致D－二聚体测定值升高，同时纤维蛋白原降低。

本例启示 取样得当是得到准确分析结果的第一步 错误的样品：凝血因子被激活，形成小凝块，形成大凝块，血少或血浆与抗凝剂比例有很大变化，凝血因子失活，凝血因子冷激活等等。

凝固法（散射光比浊法）

分析前质控 血少和血多：抗凝剂与全血的比例为1:9，不足即为血少，±10%以内为可用标本。 溶血：红细胞的胞内释放物可激活凝血系统，使凝血时间缩短，甚至形成小凝块。 脂血：严重脂血使起始散射光过高，仪器无法得到正常的凝固曲线。 红细胞压积（HCT)异常：可导致血浆与抗凝剂比例异常, 血量=抗凝剂量/0.00185/100-HCT

取血方式：一针见血，防止损伤组织导致外源性凝血因子进入试管；止血带不要扎得太紧，尽量缩短采血时间。 标本送检时间：室温条件（25℃左右）4小时，肝素监测标本2小时内测定。 防止肝素污染和因子激活或失活