实验0X 果蝇变异的遗传标记实验——同工酶凝胶电泳 （教材实验18，p85-89） 一、实验目的： 助教： 郑莹 掌握同工酶分析的方法技术 理解同工酶分析的遗传学意义 二、主要实验内容： 凝胶制备→提取酶液→活性电泳→染色分析

三、实验原理： 同工酶（isozymes）是指催化反应相同，但结构和理化性质不同的一族酶。是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。 利用电泳分离（根据分子量、电荷） 专一底物和特殊染料染色进行分析。

为节省时间，先做：架好胶板 配制分离胶（7.5%）（两组的量）： 双蒸水/mL 9 mL 电泳原理介绍 教师分头指导操作   配制分离胶（7.5%）（两组的量）： 双蒸水/mL 9 mL 1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）/mL 5 mL Acr/Bis（30%）/mL 5 mL TEMED/μL 20 μL 10%Aps/μL 100 μL 总体积/mL 20 mL 同台两组共用一电泳槽。 注入两玻璃夹缝中，胶面上加1cm蒸馏水（自然凝胶后倾出）。

本次实验涉及： 酯酶（Est）: 催化酯类化合物水解的酶系. 乳酸脱氢酶(LDH): 催化乳酸脱氢反应的酶. 过氧化物酶（PO）：催化过氧化物水解 应用： 遗传育种 2）基因定位 ……

LDH染色原理 Est染色原理 PO染色原理 乳酸 丙酮酸 LDH NAD+ NADH NBT(黄) NBTH(蓝紫) PMS（氢递体） 　　酯的水解产物与偶氮化合物（如坚牢蓝RR盐）结合产生红褐色物质． PO染色原理 　　H2O2被PO水解，此过程中染料联苯胺显色（蓝褐色）．

PO染色示意 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 LDH电泳结果实例

1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组 四、实验材料： （1）D.Virilis ------------10只 （2）黑腹果蝇--P♀、P♂、 F1♀、F1♂、 F2♀、F2♂各40只 （3）其他材料 -- 0.2g （1）、（2）的P、（3）由教师提供，（2）F1、F2用自己存的材料。

已配制的各种试剂： 1. 组织匀浆液： 100mmol/L NaCl-10mmol/L Tris·HCl （pH8.0）-25mmol/L EDTA （pH8.0） 1). 5mol/L NaCl 2). 0.5mol/L Tris·HCl pH8.0 3). 0.5mol/L EDTA pH8.0 2. 1.5mol/L Tris·HCl pH8.8（4℃存放） 3. 0.5mol/L Tris·HCl pH6.8（4℃存放） 4. 30%Acr/Bis ： 29.2gAcr+0.8gBis→双蒸水定容至100mL→过滤→4℃存放 5. 上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝-40%（W/V）蔗糖水溶液 6. 电泳缓冲液（室温）： 5×： Tris7.5g + Gly 36g→双蒸水溶解定容至500mL。使用时稀释至1 ×——老师配好。

要求自配[都做Est。7种样品点完剩余的3孔点普通果蝇、大果蝇、其他，用于LDH（背讲台组）、PO（面讲台组）： 7. 染色液 (电泳即将结束时配制完成) 配制、染色要避光 Est染液（第一桌配，240mL，均分给各组(30mL×8)） 醋酸а-萘酯 240mg→溶于12 mL丙酮中 监牢蓝RR盐 240mg →溶于12 mL丙酮中→加216 mLpH7.0磷酸缓冲液* 两者完全溶解后把前者倒入后者中，迅速搅拌均匀，避光过滤。 *pH7.0磷酸缓冲液（250mL）：10.9g Na2HPO4 溶于152.5mL 水中，3.0g NaH2PO4溶于97.5mL 水中，二者混匀。 染色约20分钟。

0.5 mol/L Tris·Cl （pH7.1） 4.4 mL （老师提供） 0.02 g NaCl 蒸馏水 55.6mL LDH染液[第2桌配，60mL]: NAD+ 30.0 mg NBT（氯化硝基四氮唑蓝） 18.0 mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1.2 mg 乳酸钠 0.7g 0.5 mol/L Tris·Cl （pH7.1） 4.4 mL （老师提供） 0.02 g NaCl 蒸馏水 55.6mL 染色约20分钟。

PO染液[第3桌配，60mL] 联苯胺 1.0 g 冰乙酸 9.0 mL 水 36 mL A液 A液 5.4 mL 30% H2O2 0.6mL 水 54mL 溶，可研磨 A液 混合成为染色液 染色5~10分钟，水洗停止反应。

五、方法步骤（合理分工、协调时间） 1. 提取酶液 每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g） （冰浴操作）  1. 提取酶液 每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g） +400μL匀浆缓冲液匀浆 （冰浴操作） 用于同工酶实验 匀浆液200μL 用于RAPD实验提取DNA 液体倒入1.5ml离心管 液体倒入1.5ml离心管 4℃，10000rpm， 10分钟 +22μL SDS、2μL的蛋白酶K 移上清于另一离心管，4℃保存。 翻转混匀（动作要轻）→55℃水浴 >2h →存-20℃

2. 4%浓缩胶的配制（两组公用量） 双蒸水/mL 6.2 mL 0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL 2.5 mL 2. 4%浓缩胶的配制（两组公用量） 双蒸水/mL 6.2 mL 0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL 2.5 mL Acr/Bis（30%）/mL 3 mL TEMED/μL 20 μL 10%Aps/μL 50 μL 总体积/mL 10 mL 加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲液中拔梳子）。 

3．  样品制备：酶液10μL与上样缓冲液10μL （1:1）混匀 5．  电泳：4℃冰箱中，100v。 （ 接近完成时配染色液！） 6. 停止电泳: 指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。 7. 染色：小心从玻璃板中取下胶。去掉浓缩胶，将分离胶进 行染色至酶带显色。 （避光，Est、LDH约20 min；PO约 5~10min） 8. 脱色、固定、保存：染色后的胶置于7%乙酸。 标记好组名，交给老师用于照相、保存。

实验报告（在记录本上做）： 迁移率Rf= 条带与分离胶起始线的距离 指示剂线与分离胶起始线的距离 目的、原理@、材料、步骤、结果（画图，填下表）、 分析 @写出检测同工酶的原理。 迁移率Rf= 条带与分离胶起始线的距离 指示剂线与分离胶起始线的距离

一级带 二级带 三级带 四级带 带型绘制方法