Wenzhou Medical College Central Laboratory of Biology 生物学实验教学中心 李 东 Wenzhou Medical College Central Laboratory of Biology

CO2培养箱 全世界的用户对二氧化碳培养箱都有两条最基本的要求，一是要求二氧化碳培养箱能够对温度、二氧化碳浓度和湿度提供最精确稳定的控制，以便于其研究工作的进展；二是要求二氧化碳培养箱能够对培养箱内的微生物污染进行有效的防范。 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 一、二氧化碳进气压力：0.08~0.1 MPa ( 0.8-1 bar ) 压力表选用：初级压力25MPa，次级压力0.2MPa 。松→紧 压力 低→高。进气正常的现象。压力过高的危害，注意安全。压力调节稳定需要时间，原因：残余气体，压力表不稳。。 二、温度控制 培养箱的最低工作温度一般是高于室温5°C ，空气循环提高温度均一性。温度恢复时间（37℃），开门时间过长，超温；水盘的水温影响。门加热系统，即使箱内相对湿度高达98%，所有内壁表面亦能保持完全干燥 。 ▼ Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 ▲幻灯片 3 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 三、二氧化碳浓度控制 按培养基中的NaHCO3设定二氧化碳浓度：NaHCO3 1.97g/L ，CO2浓度5% ； NaHCO3 3.95g/L， CO2 10% 。RPMI1640培养基每升2.1g碳酸氢钠；DMEM每升3.7克碳酸氢钠；F12 NaHCO3 1.18g/L ;DMEM/F12 NaHCO3 2.56 g/L 。 HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。 注意 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 四、相对湿度 水盘蒸发面积大，增强蒸发作用，使培养箱内能快速达到饱和湿度状态。无菌蒸馏水，定期检查、定期更换。 二氧化碳培养箱停止使用时，除水，否则发霉。 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 五、防污染和消毒灭菌 空气过滤：HEPA过滤器能过滤培养箱内空气，可过滤除去99.97%的0.3微米以上的颗粒，箱体关闭后5分钟内达到空气100级。乙醇消毒。 紫外消毒：紫外消毒能力是与紫外灯距离目标的距离的二次方成反比，距离越远，消毒能力越差，且无穿透能力，难以达到彻底灭菌的要求； 高温湿热：目前比较有效消毒灭菌的方法，高温消毒又分为两类，一是传统的高温干热消毒，另一种是先进的高温湿热灭菌。 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 六、重要提示 需要定时更换的部件：HEPA过滤器、空气过滤器 需要定时处理的工作：消毒、水盘 Wenzhou Medical College

CO2培养箱使用注意事项 ▲幻灯片 3 Wenzhou Medical College

Wenzhou Medical College Biotechnology Research Platform 细胞培养室 Wenzhou Medical College Biotechnology Research Platform

细胞培养室 无菌级别：万级，局部100 级 Nikon 倒置生物显微镜 Nikon DS-5M-L1显微摄影系统 Thermo二氧化碳培养箱 Labsystems BioMate电动移液器 Wenzhou Medical College

细胞培养室使用注意事项 细胞培养室的大小依需要而定，一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。更衣间放在外，主要供更换衣帽、鞋子等。缓冲间位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。操作间放在内间，主要供无菌操作和细胞培养，房间应不受日光直射，大小适当，高度适宜(2.5m)。房间过大，清扫和消毒不便；过小，操作不便；顶部过高会影响紫外线的有效灭菌效果。墙壁应光滑无死角，以便清洗和消毒。 Wenzhou Medical College

细胞培养室使用注意事项 细胞培养室的日常维护和操作规程： ㈠、日常维护 1、定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来 水擦地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰ 来苏尔或者新洁尔灭擦拭。 2、无菌室实验前灭菌：打开紫外灯、空气净化 器系统30分钟。 3、无菌室实验后灭菌：用75％酒精擦拭超净台 （有机玻璃面板不能用酒精擦拭）、边台、倒 置显微镜的载物台，打开紫外灯照射30分钟。 Wenzhou Medical College

细胞培养室使用注意事项 ㈡、进入无菌室的实验人员无菌准备： 1、肥皂洗手，75％酒精泡手。 2、带好手套、穿好隔离衣、拖鞋、带 好隔离帽、口罩。 3、用75％酒精棉球擦净双手（酒精不 可过多，防止着火）。 Wenzhou Medical College

细胞培养室使用注意事项 ㈢、无菌室内的操作要求和注意事项： 1、凡是带入无菌室的试剂（酒精、PBS、培养基、 胰蛋白酶等）的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶 子的外表面。 2、动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到 废液缸、手。 3、吸取两种以上的试剂时要注意更换吸管，防止 交叉污染。 4、不同细胞培养瓶（板）内使用的吸管要注意更 换，防止污染扩大。 Wenzhou Medical College

细胞培养室使用注意事项 误区：紫外灯消毒灭菌时间 。消毒的效能与距离成反比，进行空气消毒时灯管应距地面2．5 m以内；台面的消毒应在80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。 消毒的时间与效能存在一定关系，但不是绝对的：照射20 min后，有71％的细菌被消灭；40 min后79％的细菌被消灭；60 min后86％的细菌被消灭。紫外线照射时间再长也不是100％的灭菌，最多只能把90％的细菌消灭，过长的照射是没有意义的。如用于紫外线照射带菌的器皿，应与其他消毒方法结合使用，如先用75％的酒精浸泡，再照紫外线消毒灭菌等。 Wenzhou Medical College

误区：鼓风机风速要适当。超净工作台注意过滤器的效果，一般2-3年更换一次，以保持过滤器的净化效果。 细胞培养室使用注意事项 误区：鼓风机风速要适当。超净工作台注意过滤器的效果，一般2-3年更换一次，以保持过滤器的净化效果。 废液缸处理。 及时关闭空气循环器 及时关闭空调 Wenzhou Medical College

光学显微镜的使用 李 东 生物学实验教学中心

—、普通光学显微镜 显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分

—、普通光学显微镜 介质的折射率:空气(1)水(1.33)香柏油(1.515) 显微镜清晰度决定于放大倍数和显微镜的分辨力，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：R=0.61λ /N.A ， N.A＝ｎsinα/2 介质的折射率:空气(1)水(1.33)香柏油(1.515) 光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X 。

二、荧光显微镜

二、荧光显微镜 荧光显微镜滤色片参数 MWU:波长330~385nm 高通滤色片：420nm 　MWB(蓝光激发):波长450~480nm 高通滤色片：515nm 观察绿色荧光的样品， 例：FITC（激发490 nm，荧光波长520 nm） EB： 激发波长488 nm, 发射波长620 nm （RNA ，DNA ：红色；可进入死细胞 ） 　AO PI： 激发波长495 nm，发射波长530 nm （DNA ：绿色；RNA：红色；可进入活细胞）WIG(绿光激发):波长510~550nm 高通滤色片：590nm　 观察红色荧光的样品

二、荧光显微镜 荧光显微镜和普通显微镜的区别： 照明方式通常为落射式，即光源通过 物镜投射于样品上； 2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

三、倒置相差显微镜 可以观察未经染色的标本和活细胞。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。

三、倒置相差显微镜

三、倒置相差显微镜 相差显微镜与普通光学显微镜的不同点： 1、 环形光阑位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 1、 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴 后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2.、 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。

用ＭＴＴ比色法测定细胞相对数 取有贴壁细胞培养板的，每孔内加入5mg/ml ＭＴＴ 20μl，4ｈ后每孔加入50%二甲亚砜水溶液150μL，振荡10 Min，570 nm(或490nm)处测定OD值，作为细胞相对数。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 Wenzhou Medical College

制备细胞爬片 1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌 后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数 后的细胞悬液（细胞密度为2×104/ml）。 再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖 满盖玻片。将培养皿（6孔细胞培养板） 置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的 CO2培养箱中培养。 2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的 底面。 Wenzhou Medical College

制备细胞爬片 3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的 密度后取出培养皿中止培养（一般为3-5 天）。 天）。　 4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗 涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。 5、加 10%中性甲醛（或-20℃预冷的丙酮） 固定 10～15min。 6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。 Wenzhou Medical College

制备细胞爬片 7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。 8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。 Wenzhou Medical College

1、在细胞爬片上加0.03% Triton X-100 水溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞浆，此步可考虑省略） 细胞爬片的免疫化学染色法  1、在细胞爬片上加0.03% Triton X-100 水溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞浆，此步可考虑省略） 2、 吸除0.03% Triton X-100，加3%H2O2 孵育10min。 3、 吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封闭30～60min。PBS 洗5min。 Wenzhou Medical College

5、 吸去一抗，PBS 漂洗3 次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗体-HRP多聚体，37℃孵育30min。 细胞爬片的免疫化学染色法 4、 吸除PBS，分别滴加相应的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS 液稀释到合适滴度），置于37℃孵育1h，或置于4℃冰箱中过夜。阴性对照片此步用PBS 替代一抗。 5、 吸去一抗，PBS 漂洗3 次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗体-HRP多聚体，37℃孵育30min。 Wenzhou Medical College

6、 PBS 漂洗3 次，每次5min。新鲜配制DAB 显色液，滴加后作用3～5min，置于显微镜下观察染色结果。 细胞爬片的免疫化学染色法 6、 PBS 漂洗3 次，每次5min。新鲜配制DAB 显色液，滴加后作用3～5min，置于显微镜下观察染色结果。 7、 双蒸水漂洗后，滴加苏木精染液，染色10min。 8、 双蒸水漂洗后，滴加0.5%HCl-70%Ethanol，作用1min 以分色。 Wenzhou Medical College

10、双蒸水漂洗1min，然后将细胞爬片经70%、80%、95%、100%、100%乙醇 各1～2min 梯度脱水。 细胞爬片的免疫化学染色法 9、 双蒸水漂洗后，滴加1%NaHCO3 作用3～5min 以蓝化细胞核。 10、双蒸水漂洗1min，然后将细胞爬片经70%、80%、95%、100%、100%乙醇 各1～2min 梯度脱水。 11、入二甲苯透明2 次，每次5min。 12、室温下晾干，用中性树胶封片。 13、显微镜下观察染色结果，并拍照。 Wenzhou Medical College

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