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微丝染色及形态观察 [目的要求] 1. 掌握微丝的染色方法。 2. 了解光镜下微丝的基本形态结构。
3. 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。
![微丝染色及形态观察 [目的要求] 1. 掌握微丝的染色方法。 2. 了解光镜下微丝的基本形态结构。](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/1/%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E6%9F%93%E8%89%B2%E5%8F%8A%E5%BD%A2%E6%80%81%E8%A7%82%E5%AF%9F+%5B%E7%9B%AE%E7%9A%84%E8%A6%81%E6%B1%82%5D+1.+%E6%8E%8C%E6%8F%A1%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E7%9A%84%E6%9F%93%E8%89%B2%E6%96%B9%E6%B3%95%E3%80%82+2.+%E4%BA%86%E8%A7%A3%E5%85%89%E9%95%9C%E4%B8%8B%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E7%9A%84%E5%9F%BA%E6%9C%AC%E5%BD%A2%E6%80%81%E7%BB%93%E6%9E%84%E3%80%82.jpg "3. 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。")
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[实验原理] 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。
![[实验原理]](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/2/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E5%8E%9F%E7%90%86%5D.jpg "真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。")
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当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。 应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。
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微丝在细胞内的分布特征
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[实验用品] 器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。 材料：盖玻片培养的成纤维细胞 试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1％TritonX-100溶液、M-缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg /ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。
![[实验用品] 器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。 材料：盖玻片培养的成纤维细胞.](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/6/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E7%94%A8%E5%93%81%5D+%E5%99%A8%E5%85%B7%EF%BC%9ACO2%E6%81%92%E6%B8%A9%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%AE%B1%E3%80%81%E5%80%92%E7%BD%AE%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C%E3%80%81%E8%B6%85%E5%87%80%E5%B7%A5%E4%BD%9C%E5%8F%B0%E3%80%81%E4%BD%8E%E9%80%9F%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA%E3%80%81%E6%99%AE%E9%80%9A%E5%85%89%E5%AD%A6%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C%E3%80%81%E7%A7%BB%E6%B6%B2%E5%99%A8%E3%80%81%E6%81%92%E6%B8%A9%E7%AE%B1%E3%80%81%E9%95%8A%E5%AD%90%E3%80%81%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%9A%BF%E3%80%81%E8%BD%BD%E7%8E%BB%E7%89%87%E3%80%81%E7%9B%96%E7%8E%BB%E7%89%87%E3%80%81%E5%90%B8%E6%B0%B4%E7%BA%B8%E3%80%82+%E6%9D%90%E6%96%99%EF%BC%9A%E7%9B%96%E7%8E%BB%E7%89%87%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%9A%84%E6%88%90%E7%BA%A4%E7%BB%B4%E7%BB%86%E8%83%9E..jpg "试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1％TritonX-100溶液、M-缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg /ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。")
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[实验步骤] 1. 培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于37℃、5%CO2的温箱中生长24h～48h。 （设正常生长组和细胞松弛素B处理组） 2. 染色处理 （1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一角轻轻滴加3 4滴），洗去表面的培养液。 （2）抽提 吸弃PBS，加入1% Triton X-100液4-5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理25 ～30min（或置37℃18min）。
![[实验步骤] 1. 培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中，于37℃、5%CO2的温箱中生长24h～48h。 （设正常生长组和细胞松弛素B处理组） 2. 染色处理.](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/7/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E6%AD%A5%E9%AA%A4%5D+1.+%E5%9F%B9%E5%85%BB+%E5%9C%A8%E6%88%90%E7%BA%A4%E7%BB%B4%E7%BB%86%E8%83%9E%E8%BF%9B%E8%A1%8C%E4%BC%A0%E4%BB%A3%E5%9F%B9%E5%85%BB%E6%97%B6%EF%BC%8C%E5%B0%86%E5%B7%B2%E6%B6%88%E6%AF%92%E7%9A%84%E7%9B%96%E7%8E%BB%E7%89%87%E6%B6%82%E4%B8%8A%E5%A4%9A%E8%81%9A%E8%B5%96%E6%B0%A8%E9%85%B8%EF%BC%8C%E6%94%BE%E5%85%A5%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%9A%BF%E4%B8%AD%EF%BC%8C%E4%BA%8E37%E2%84%83%E3%80%815%25CO2%E7%9A%84%E6%B8%A9%E7%AE%B1%E4%B8%AD%E7%94%9F%E9%95%BF24h%EF%BD%9E48h%E3%80%82+%EF%BC%88%E8%AE%BE%E6%AD%A3%E5%B8%B8%E7%94%9F%E9%95%BF%E7%BB%84%E5%92%8C%E7%BB%86%E8%83%9E%E6%9D%BE%E5%BC%9B%E7%B4%A0B%E5%A4%84%E7%90%86%E7%BB%84%EF%BC%89+2.+%E6%9F%93%E8%89%B2%E5%A4%84%E7%90%86..jpg "（1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一角轻轻滴加3 4滴），洗去表面的培养液。 （2）抽提 吸弃PBS，加入1% Triton X-100液4-5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理25 ～30min（或置37℃18min）。")
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（3）稳定 吸弃Triton X-100，立即用M-缓冲液轻
轻地洗涤3次，每次3min。 （4）固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min， 再以PBS液洗3次，洗去固定液。 （5）染色 滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色20 30min，然后小心的用自来水漂洗。 （6）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水 纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。
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[实验结果] 光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。
![[实验结果] 光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/9/%5B%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E7%BB%93%E6%9E%9C%5D+%E5%85%89%E9%95%9C%E8%A7%82%E5%AF%9F%EF%BC%8C%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E8%81%9A%E9%9B%86%E6%88%90%E7%9A%84%E5%BA%94%E5%8A%9B%E7%BA%A4%E7%BB%B4%E6%9D%9F%E8%A2%AB%E6%9F%93%E6%88%90%E8%93%9D%E8%89%B2%EF%BC%8C%E5%9C%A8%E6%B2%A1%E7%94%A8%E8%8D%AF%E7%9A%84%E6%A0%87%E6%9C%AC%E4%B8%8A%EF%BC%8C%E6%88%90%E7%BA%A4%E7%BB%B4%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%A4%9A%E6%95%B0%E6%9C%89%E7%AA%81%E8%B5%B7%EF%BC%8C%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E6%B2%BF%E7%AA%81%E8%B5%B7%E8%A7%84%E5%88%99%E6%8E%92%E5%88%97%EF%BC%9B%E7%94%A8%E7%BB%86%E8%83%9E%E6%9D%BE%E5%BC%9B%E7%B4%A0B%E5%A4%84%E7%90%86%E7%9A%84%E6%A0%87%E6%9C%AC%EF%BC%8C%E7%94%B1%E4%BA%8E%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E8%A2%AB%E7%A0%B4%E5%9D%8F%E3%80%81%E7%AA%81%E8%B5%B7%E7%BC%A9%E5%9B%9E%E3%80%82%E5%A4%9A%E6%95%B0%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%BD%A2%E7%8A%B6%E5%8F%98%E5%9C%86%EF%BC%9B%E7%94%A8%E8%8D%AF%E5%A4%84%E7%90%86%E5%90%8E%E5%8F%88%E6%B4%97%E5%8E%BB%E8%8D%AF%E7%9A%84%E6%A0%87%E6%9C%AC%EF%BC%8C%E7%94%B1%E4%BA%8E%E8%A7%A3%E9%99%A4%E4%BA%86%E8%8D%AF%E7%9A%84%E4%BD%9C%E7%94%A8%EF%BC%8C%E8%82%8C%E5%8A%A8%E8%9B%8B%E7%99%BD%E9%87%8D%E6%96%B0%E8%81%9A%E5%90%88%E6%88%90%E5%BE%AE%E4%B8%9D%EF%BC%8C%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%BD%A2%E7%8A%B6%E6%81%A2%E5%A4%8D%E6%AD%A3%E5%B8%B8%E3%80%82.jpg "[实验结果] 光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。")
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1．光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）。
2．注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别。 3．观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常。
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光学显微镜下微丝分布图
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[注意事项] 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。 2. 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理 前的状态。
3．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。 4．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。 5．TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过 长而导致细胞结构的破坏。
![[注意事项] 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。 2. 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理 前的状态。](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/12/%5B%E6%B3%A8%E6%84%8F%E4%BA%8B%E9%A1%B9%5D+1.+%E6%B4%97%E7%89%87%E6%97%B6%E8%A6%81%E8%BD%BB%E6%9F%94%EF%BC%8C%E4%BB%A5%E5%85%8D%E6%8A%8A%E7%BB%86%E8%83%9E%E4%BB%8E%E8%BD%BD%E7%8E%BB%E7%89%87%E4%B8%8A%E6%B4%97%E5%8E%BB%E3%80%82+2.+%E6%81%A2%E5%A4%8D%E6%97%B6%E9%97%B4%E8%A6%81%E8%B6%B3%E5%A4%9F%EF%BC%8C%E5%90%A6%E5%88%99%E7%BB%86%E8%83%9E%E4%B8%8D%E4%BC%9A%E6%81%A2%E5%A4%8D%E5%88%B0%E6%9C%AA%E5%A4%84%E7%90%86+%E5%89%8D%E7%9A%84%E7%8A%B6%E6%80%81%E3%80%82.jpg "3．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。 4．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。 5．TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过. 长而导致细胞结构的破坏。")
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[作业与思考题] 1．比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？ 2．实验中设计对照组的作用及重要性？
3．TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯 亮蓝在本实验中所起作用？
![[作业与思考题] 1．比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？ 2．实验中设计对照组的作用及重要性？](http://slidesplayer.com/slide/16434774/96/images/13/%5B%E4%BD%9C%E4%B8%9A%E4%B8%8E%E6%80%9D%E8%80%83%E9%A2%98%5D+1%EF%BC%8E%E6%AF%94%E8%BE%83%E4%B8%89%E7%A7%8D%E4%B8%8D%E5%90%8C%E6%83%85%E5%86%B5%E4%B8%8B%E7%BB%86%E8%83%9E%E4%B8%AD%E5%BE%AE%E4%B8%9D%E7%9A%84%E5%88%86%E5%B8%83%E7%89%B9%E7%82%B9%EF%BC%9F+2%EF%BC%8E%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E4%B8%AD%E8%AE%BE%E8%AE%A1%E5%AF%B9%E7%85%A7%E7%BB%84%E7%9A%84%E4%BD%9C%E7%94%A8%E5%8F%8A%E9%87%8D%E8%A6%81%E6%80%A7%EF%BC%9F.jpg "3．TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯. 亮蓝在本实验中所起作用？")
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