第九节 基因工程药物的 质量控制 是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。

宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。

一、 原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。

根据质量控制要求应了解以下 特性： ⒈明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证；

⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物； ⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；

⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性； ⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。

二、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。

生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。

原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。

对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；

在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。

培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。

三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。

在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。

四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。

⒈产品的鉴别 常用的鉴定方法: 电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、免疫电泳 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分 析、圆二色谱、核磁共振

⑴ 肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。

⑵ 氨基酸成分分析 50个氨基酸较理想 ⑶ 部分氨基酸序列分析 N端15个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。

⑷ 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定 蛋白质浓度测定方法有:福林-酚法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤法、SD-SPAGE法

⑸ 蛋白质二硫键分析 测定方法有: 对氯汞苯甲酸法等 5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸法

⒉ 纯度分析 ⑴蛋白质含量测定 SDS-PAGE、等电聚焦、各种HPLC、 毛细管电泳 ⑵杂质 ①蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法 ②非蛋白类杂质

②非蛋白类杂质 非蛋白类杂质主要有: 病毒、细菌等微生物、热原、 内毒素、致敏源及DNA。

常用检测方法： 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热原法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热原法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE 其它蛋白杂质 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE 残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 甲酰蛋氨酸 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 蛋氨酸氧化 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤

杂质和污染物 检 测 方 法 单克隆抗体 SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE 微生物 微生物学检查 支原体 微生物学检查 病毒 微生物学检查

⒊生物学活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。 ⒋稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。 ⒌产品一致性的保证

五、产品的保存 ⒈液态保存 ⑴低温保存 ⑵在稳定的下保存 ⑶高浓度保存 ⑷加保护剂保存 ⒉固态保存

第十节　基因工程药物制造实例 　　　干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b α2a α2b等亚型。 一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC

第十节　基因工程药物制造 实例 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b α2a α2b等亚型。

一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC

筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达

二、基因工程干扰素的制备 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装

α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白冻0.5%酵母提取物0.5%NACl。摇床培养30 C，10h，发酵种子。15L发酵罐培养， 30 C，8h。然后42 C，3h。离心去上清。 o o o

2.产品的提取与纯化 湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓 缩，Sephadex G50 分离。 经SDS-PAGE检查。 在经DE-52柱纯化。

三、质量控制标和要求 ⒈半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定

⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清igG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。

⒉成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验