Real Time Quantitative PCR 北京康为世纪生物科技有限公司 1

内 容 miRNA的特点及检测 荧光定量PCR检测

microRNA

microRNA分子功能 长度20∼24nt 单链小分子RNA 与目标基因3’端非编码区的识别位点相结合 导致目标基因mRNA分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA分子结构变化（5‘脱帽），从而表达水平下降。 3’ AAAAAAAA 5’cap miRNA作用靶点 编码区 mRNA

microRNA 的来源

miRNA前体与成熟体

靶点识别–不严格互补配对 一个miRNA可调节多个基因 一个基因可受多个miRNA调控 60%人类蛋白基因受miRNA调控

miRNA 与 siRNA的异同 分子形式无区别，都是由Dicer产生的~22nt小分子 产生来源不同 miRNA有其基因，内源性表达 siRNA多数情况下为人工外源导入

miRNA 与 siRNA的异同 miRNA siRNA

miRNA 检测与定量 经典方法: 放射标记 Northern杂交

miRNA芯片–基因表达谱 基本原理：某物种全部已知miRNA集中于一张芯片，点杂交检测各miRNA丰度 优点：高通量，全景观察 缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛 需后续验证：荧光定量PCR

Pre-miRNA检测 必要性： 不排除miRNA从前体到 成熟体，从核内转运到 核外的过程中存在调控 机制的可能。

Specific miRNA quantification by real time PCR – way to go 关键难点 丰度低 解决办法:小RNA提取 太短 解决办法: 加长 序列高度相似miRNA之间难以区分 解决办法 : 特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化

解决miRNA丰度难题 小RNA提取 基本原理 影响RNA分子与硅胶柱结合的因素 离液剂chaotropic agent，如盐酸胍 离子强度，如NaCl 小分子有机溶剂，如乙醇 精心调整各组份配比，达成大、小RNA与 硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量 RNA，富集小分子量RNA

提取小分子量RNA M：Marker #1：康为柱式分离的小片段RNA #2：康为柱式分离的总RNA #3：沉淀法得到的总RNA

成熟 miRNA qPCR检测 - Poly(A)加尾法 优点： 简单直接，高效。一次逆转 录获得的cDNA可用于多个 目标分子的检测。

成熟 miRNA qPCR检测 – 茎环法 优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏 缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测

检测方法选择 依样本特性，检测目标多寡而定 康为技术服务经验举例： 复旦大学某客户 miRNA芯片提示10个miRNA在病人与正常人之间有显著差异表达 要求从66个外周血RNA样本中检测这10个miRNA 加尾法 ，5个目标获得良好检测 茎环法，4个目标获得良好检测 1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系

康为miRNA产品 小RNA提取试剂盒 加尾法 miRNA cDNA第一链合成试剂盒 miRNA荧光定量PCR检测试剂盒 CW0627

康为miRNA检测服务 全套miRNA检测：从生物样本到数据 茎环法 miRNA检测引物：定制

(Real time Quantitative PCR) 内 容 miRNA的特点及检测 荧光定量PCR检测 (Real time Quantitative PCR) 22

PCR： 伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology 1985年发明，science，1993年诺贝尔；92年日本人 概念，95年PE Taqman

PCR：理想与现实 起点定量检测： 终点定量检测： -- 起点量是样本中未经PCR放大 之前的模板量 -- 具有重现性，误差小 -- “加入了500个拷贝” 终点定量检测： - 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 不恒定，误差大 -- “生成了500，0000，0000个拷贝”

确定模板初始数量？ 模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少， 即Ct值越小。 扩增曲线 -- Ct值： 扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，通过荧光信号检测扩增产物的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所对应的PCR循环次数。 扩增曲线 -- Ct值： 模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少， 即Ct值越小。 25

Real-time PCR: 检测原理 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针：Molecular beacon R Q Reporter Quencher

SYBR Green I 工作原理 SG 5’ 3’ SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。 Emission Excitation SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。 SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。 荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。

Taqman 工作原理 荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。 在退火过程中，探针与靶序列结合 在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 游离报告基团发出荧光 荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。

染料法与探针法 对比 染料法 通用性好 使用方便，成本低 有假阳性现象 探针法 特异性高 对模板有选择性 成本高 -- 对DNA模板没有选择性 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物 有假阳性现象 -- 通过融解曲线判断 探针法 特异性高 -- 与探针与特异靶序列结合 对模板有选择性 -- 可进行多重PCR反应 成本高 -- 不同靶基因需要合成不同探针

Real-time PCR 应用 基因表达分析 -- 相对定量：基因表达量的差异 -- 绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克） 基因型分析 -- SNP检测 等位基因检测 甲基化检测

基因表达分析检测 total RNA total RNA cDNA cDNA qPCR qPCR 以各自样本中内参基因为标杆， test sample 处理样本 calibrator sample 对照样本 cDNA total RNA total RNA cDNA qPCR qPCR target gene 目的基因 reference gene 内参基因 target gene 目的基因 reference gene 内参基因 数据分析 以各自样本中内参基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度。

内参基因的选择 内参基因Housekeeping Gene 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 -- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。 选择内参基因 特点 -- 文献检索 -- 实验筛选 选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准 内参基因 不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等

Housekeeping Gene 康为产品 不同丰度： 高丰度 ACTB、GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 不同物种： 人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等

基因表达分析检测 样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因(housekeeping gene)选择

样本处理与RNA提取 外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA的评价与鉴定 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ - 引物设计 - 以RNA作PCR阴性对照 CW0592 CW0580 CW0581 CW2090A

RT-qPCR一步法还是两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。 推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。 一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。 推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。

逆转录 逆转录引物选择 逆转录酶 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录酶 SuperRT 逆转录酶（RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-） 引物 特异性 反应效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer Specific primer 高 CW0741 CW0743

引物设计原则 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 – 300 bp) 推荐做跨intron设计 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA

反应条件优化 内参基因 – 目的基因 -- 融解曲线：单一特异性产物 -- 扩增曲线：Ct值 -- 标准曲线： 扩增效率尽量高，目的基因 尽可能接近内参基因

反应条件优化 融解曲线分析 -- 单一特异性产物 将温度对荧光强度的变化求导

反应条件优化 标准曲线分析 -- 扩增效率尽量高 -- 目的基因尽可能接近内参基因 10%以内 图1 Effciency slope 100% -3.32 目的基因 Primer 1 95.36% -3.43 图2 Effciency slope 内参基因 100% -3.32 目的基因 Primer 2 78% -4.00

反应条件优化 扩增曲线分析 -- Ct值

Master Mix的应用 -- 热启动酶 -- Buffer -- dNTP 化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95℃ 10分钟 -- GoldStar、HotStar 非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物） 热复活仅需95℃几十秒 --FastStar -- Buffer 反应增强剂 -- 减少引物二聚体，进一步提高反应特异性 -- 对于复杂模板，提高反应效率 稳定剂 -- dNTP

Master Mix的应用 ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 需参照仪器要求选择。

荧光定量PCR体系 误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复 （不同个体） 技术性重复（复孔） 阴性对照

2、待测样本的ΔCT值-对照样本的ΔCT值 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值 相对定量数据分析 2-ΔΔ Ct法 满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10% 2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110% 1、目标基因的CT值-内参基因的CT值 2、待测样本的ΔCT值-对照样本的ΔCT值 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值 2-△△Ct 法　 目的 基因 内参 目的基因 -内参基因 △Ct 待测样本 -对照样本 △△Ct 倍数值 fold 2-△△Ct 对照样本 30.485 23.625 6.86 1 27.025 22.66 4.365 -2.495 5.63728 46

Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法 Housekeeping gene 无信号 RNA降解 用新鲜组织提取RNA 有信号 而目标基因无信号 1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。 3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。 反应效率正常,但 目标基因放大效率不高 PCR引物不良 重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段， 考虑不同剪接体 目标基因表达丰度在 样本之间异常一致 RNA被基因组DNA污染 使用跨intron 引物 用DNase处理RNA 确保RNA阴性对照表现阴性 溶解曲线出现杂峰 出现非特异PCR产物 出现引物二聚体 尝试不同PCR引物 尝试不同热循程序，升高复性温度 修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。 阴性对照在30个循环 以内出现信号 试剂被污染 注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物 查找，替换污染试剂 2. 使用UNG系统。

荧光定量产品--染料法 UltraSYBR Mixture FastSYBR Mixture 反应速度快 比普通反应可节省约40分钟 适合于普通和快速定量PCR程序 GoldStar Taq 特异性强 灵敏度高 Ct值更低 线性范围更广 定量更准确

荧光定量产品--染料法 - cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。 - 模板浓度进行10倍稀释，稀释6个梯度。 某其它品牌 康为 UltraSYBR - cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。 - 模板浓度进行10倍稀释，稀释6个梯度。

康为世纪产品 RNA -- Trizol --超纯RNA提取试剂盒 -- 动物组织RNA -- 植物RNA -- 血液RNA -- 病毒RNA 逆转录 --SuperRT / HiFi-MMLV逆转录酶 -- cDNA第一链合成试剂盒 --RT-PCR 一步法、两步法试剂盒 荧光定量PCR -- UltraSYBR Mixture -- FastSYBR Mixture -- GoldStar Taqman Mixture PCR -- GoldStar DNA Polymerase -- Taq /Es Taq DNA Polymerase -- Taq /Es Taq Master Mix

外包服务 CoWin解决方案一：Primer assay CoWin解决方案二：全套qPCR服务 Housekeeping gene – 引物序列？反应条件？ 目标基因– 引物序列？反应条件？ 选择试剂，摸索条件，优化参数 – 两个月？ CoWin解决方案一：Primer assay 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix 客户下游工作：Real-time PCR – 数据获取 CoWin解决方案二：全套qPCR服务 客户提供：生物样本 客户得到：数据报告，剩余样品。 客户下游工作：写论文; 得诺贝尔奖

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