東吳大學 微生物學系 P2 教學實驗室訓練課程（2） 黃顯宗 97.11.

內容 生物醫療科技產業生物性危害 生物危害健康風險評估 P2實驗室規劃設計與空調 生物安全操作台、運作與檢測 生物安全實驗室操作規範 消毒與滅菌 P2實驗室之防護具使用 本系P2實驗室之規範

生物安全實驗室操作規範 P2級 黃顯宗 97.11.

生物實驗室物安全等級 Biosafety levels 生物安全等級一(BSL-1) 生物安全等級二(BSL-2) 國科會稱為P1-P4

生物安全等級二(BSL-2) BSL-2與BSL-1相似 相異處在 實驗室工作人員受過使用致病原的特殊訓練，並由適任的科學家指導 工作進行中須管制門禁 特別小心受污染的尖銳物品 操作步驟可能產生氣霧或濺灑者，須使用生物安全操作櫃或物理性圍堵設備

BSL-2標準微生物操作程序 實驗進行中，實驗室主管有權管制實驗室門禁 工作人員處理活性材料，脫掉手套後與離開實驗室前須洗手 工作區內禁止飲食、抽煙、處理隱形眼鏡、化粧和貯存食物。實驗室內使用隱形眼鏡人員，仍須戴眼罩或面具。食物僅可置於工作區外，專用的櫃子與冰箱內 禁止用嘴吸取溶液、樣品；僅允許使用機械式吸取器 建立安全處理尖銳物的政策 小心操作任何程序，以減少濺灑及氣霧的產生 工作檯面須完成工作後或每天結束工作後清理消毒，倘若灑落任何具活性材料，須立即以對該病原有效之消毒劑進行消毒 所有培養物、貯存物、及其它管制廢棄物，在丟棄前均需依認可的高溫高壓滅菌法處理。若消毒須在臨近實驗室處進行時，所有物品須置於耐用、防漏密閉的容器中，以利安全運送。假使消毒須在遠離實驗室所在處進行時，待消毒物品的包裝則需依照政府相關單位的規定處理，才可運送 實施昆蟲及鼠類的例行性防治

BSL-2特殊操作程序 實驗室主管嚴格管制實驗室門禁，僅實際工作者及支援人員得以進出。先天免疫缺乏者、高危險性後天感染者，或感染後會產生嚴重後果者，禁止進入實驗室及動物房。實驗室主管有責任且具職權管制人員進出實驗室與動物房。 實驗室主管訂定實驗室守則與遵行步驟。僅有具備瞭解生物危險物質知識、符合特殊規定(如：免疫接種)，並遵循出入步驟者，才得進入實驗室。 當操作病原生物時，實驗室入口須貼上生物危險警告標誌，標誌需寫上使用之病原、生物安全等級、需要的預苗接種，並註明實驗室主管或其它負責人的名字、電話號碼、進入實驗室需穿著的個人保護設備和離開實驗室的步驟程序。 實驗室工作人員，在使用或接觸可能存在於實驗室的感染原前，須接受適當的免疫接種或試驗(如：B型肝炎疫苗接種或TB皮膚試驗)。 收集並保存實驗室所有工作及高危險群人員血清檢體。此外，根據實驗室的功能及操作的病原，定期蒐集血清檢體。 生物安全程序須併入標準操作程序或實驗室負責人制訂之生物安全守則。工作人員須被告知可能接觸到的特殊危險物，熟讀及遵循必要的操作及使用準則。

BSL-2特殊操作程序 實驗室工作人員，必須接受感染性病原的使用防護措施及評估暴露量方法之訓練。此外，工作人員每年應有最新的參考資料，若有修訂任何程序步驟則須再接受額外的訓練。 處理遭感染的尖銳物品，包括：注射筒、玻璃片、吸管、毛細管及解剖刀，須極度小心。 僅在無適當的取代物時，例如：腸胃外的注射、放血、實驗動物組織液的抽取、隔膜瓶上吸液，才使用針頭及注射筒或其它尖銳物品。並儘可能使用塑膠器材。 僅可使用針頭固定式注射筒或可棄式針頭/注射筒組(即針頭/注射筒為一體的完全針筒)於注射或抽取感染性材料。使用過的可棄式針頭丟棄前，不可彎曲、折斷、套回套管、由針筒取下、及徒手處理，而應該即刻置於防刺破容器內棄置。至於，不可棄式尖銳物品，則須放入厚壁容器內，運送到清毒區域，以高溫高壓滅菌。 視實際情形，適當使用可重覆套針頭的注射筒，針頭去除器及其它安全設備。 不可徒手處理破碎玻璃器皿，而須使用機械式器具，如：掃帚與畚斗、鉗子、鑷子等。裝有感染性針頭、尖銳物品及破碎玻璃的容器須先經消毒，再依據適當的法令規定處置

BSL-2特殊操作程序 以防漏容器收集、處理、貯存、傳遞、運送培養物、組織、組織液樣本或潛在感染性廢棄物。 除定期消毒外，在使用及有明顯翻灑感染性材料後或其它污染情形發生時，儀器及工作檯面須以適當的殺菌劑消毒。受污染的儀器依照政府相關單位的規定消毒及包裝後，才得移出維護修理。 當發生翻灑或明顯的暴露於感染性材料時，須立即報告主管，送醫診療，並保存完整的處置記錄 與工作無關的動物不得出現在實驗室內。

BSL-2安全設備(初級防護設備) 維護良好的II級生物安全操作台、其它適當的個人防護設備或物理性防護設備，須使用於下列情況： 操作步驟可能產生氣霧或濺灑者：離心、研磨、攪拌、劇烈搖盪或混合、超音波震盪，開啟內外壓差大裝有感染性物質的瓶子時，經由鼻內感染動物時，或由動物或蛋中取出感染組織時。 使用高濃度或大量感染性材料時，可在一般開放性實驗室中，以密封式的離心器及安全杯離心。而且，離心後僅能在生物安全操作台中開啟。 在生物安全操作台外處理感染性或其它物質時，如果預期有微生物或其它危險材料濺灑臉部，則須適當的使用臉部保護器材(眼罩及口罩或面具)。 實驗室內須穿著保護衣物，如：實驗衣、清潔衣、工作服或制服，並且不得穿離實驗室至非實驗室(如餐廳等)。所有保護性衣物須在實驗室內丟棄，可重覆使用者則由工作單位清洗，不得攜回家。 當處理感染性動物、用手接觸感染性材料或受污染的表面和儀器時，須戴手套。穿戴雙層手套是適當的。當完成處理感染性材料或當手套完整性有疑慮時，即刻丟棄。手套不得穿戴離實驗室。丟棄式手套不能清洗、重覆使用或穿戴去碰觸乾淨表面(如鍵盤、電話等)。脫掉手套後需洗手。

BSL-2實驗室設備(二級防護設施) 存放管制病原之設施須能上鎖。 實驗室儘量離開公共區域。 每間實驗室內設有洗手槽。 實驗室是依照易於清洗及管理的原則而設計建造，不宜鋪地毯。 工作檯面須防水，耐相當的熱度與有機溶劑、耐酸與鹹、和用於消毒工作檯面與設備之化學藥劑。 實驗室的傢俱必須堅固，工作檯、櫃及設備空間安排須得宜，以利清理。實驗操作使用之椅子和其它裝璜應包覆非織布材質，以利消毒。。 正確安裝生物安全操作台，使其進氣與排氣的波動，不會啟動圍堵措拖之參數。生物安全操作台須遠離門、能開啟的窗戶、走動頻繁的實驗室區域、和潛伏導致混亂的設備，以維持生物安全操作台做為圍堵功能之氣流參數穩定 設置洗眼站。 適當的照明設計，避免有損視覺的反射與刺眼強光。 無特殊排氣需求，但新建築應設計之機械排氣系統，且避免內部空氣與排到實驗室外之氣流一起循環。與外界相通的窗戶需加裝紗窗。

國科會P2實驗室標誌

BSL-2標誌

消毒與滅菌

名詞定義 抗微生物藥(Antimicrobial)：可殺死或抑制微生物生長和繁殖之藥劑 防腐劑(Antiseptic)：抑制微生物生長和發育之物質，未必能殺死微生物，一般使用於體表之消毒 生物殺傷劑(Biocide)：指一般能殺死單細胞與多細胞生物之藥劑 化學殺菌劑(Chemical germicide)：用於殺死微生物特別是病原細菌之化學藥劑或化學藥劑混合劑 除污(Decontamination)：任何去除或殺死微生物的過程，亦指去除或中和有害之化物藥品和放射物質之過程 消毒劑(Disinfectant)：用於殺死微生物之化學藥劑或化學藥劑混合劑。消毒劑未必能殺死內孢子，一般用於非生物性物品或物品表面之消毒 消毒(Disinfection)：使用物理或化學方法殺菌，但未必能殺死內孢子 微生物殺傷劑(Microbicide)：指一般能殺死微生物之藥劑，常用於取代Biocide、germicide與Antimicrobial 滅菌(Sterilization)

化學殺菌劑--氯劑 次氯酸鈉(sodium hypochlorite)：或稱漂白劑(bleach)，具強鹹性，會腐蝕金屬，有機物質(如蛋白質)會大大減低其活性，存放在高溫未密封容器之原液或作用濃度液(working solution)，會因氯氣之釋放與揮發而降低殺菌效力。 注意毒性，注意通風

化學殺菌劑--氯劑 Sodium dichloroisocyanurate：Sodium dichloroisocyanurate (NaDCC)為粉劑，含60%有效氯，被做成靛劑(tablet)，容易貯存且安全。

化學殺菌劑--氯劑 氯亞明(Chloramines)：氯亞明為粉劑，含25%有效氯，釋放氯之速率低於漂白劑，因此須製備較高之初始濃度，但其活性不似漂白劑般易與有機物質作用而快速降低。氯亞明無明顯味道，但浸泡過之物品需徹底清洗，以去除附著之粉末。

化學殺菌劑--氯劑

化學殺菌劑--醛(Aldehydes) 甲醛(Formaldehyde)：甲醛氣體在20℃能殺死所有種類的微生物與其內孢子，但對prions無效。甲醛作用速度慢，需在高於70%相對濕度環境下作用。 市場上販售之固態甲醛(paraformaldehyde)或液態的福馬林(formalin，含37%甲醛，和10%甲醇為穩定劑)，兩種製劑加熱產生甲醛氣體，可用於生物安全操作櫃和房間等密閉空間的除污與消毒。 5%的福馬林可做為液態消毒劑。甲醛被懷疑是致癌物，具刺激性，煙霧會刺激眼睛與黏膜，須在煙霧櫃或通風良好場所中存放和使用。使用前需先咨詢化學安全相關規定。

化學殺菌劑--醛(Aldehydes) 雙乙醛(Glutaraldehyde)：類似於甲醛，雙乙醛對細菌營養體和內孢子、真菌、含脂和非含脂病毒有效，其不具腐蝕性，作用比甲醛快，但需費時數小時才能殺死細菌內孢子。 一般市場販售的是2%的雙乙醛溶液，大部份產品使用前需加碳酸(bicarbonate)調高pH值加以活化，活化之溶液依據其配方和使用頻率可使用1-4週，溶液若混濁即應丟棄

化學殺菌劑--酚化合物(Phenolic compounds) ，有些種類(triclosan、chloroxylenol)常用做防腐劑。Triclosan常用於洗手，對細菌營養體有效，對皮膚和黏膜相當安全，然而實驗室研究顯示，有些細菌對低濃度triclosan產生抗性，也同時對某些類的抗生素產生抗藥性

化學殺菌劑--四價胺化合物(Quaternary ammonium compounds) 許多四價胺化合物經常與其它殺菌劑(如酒精)混合使用，對細菌營養體和含脂病毒有效 某些四價胺化合物殺菌活性受到有機物、水的硬度、和陰離子清潔劑的影響而降低，使用此類化合物做為消毒劑，標的物應先進行清洗工作 四價胺化合物不易進行生物分解，易累積於環境中。

化學殺菌劑--醇(Alcohols) 乙醇與異丙醇有相似的消毒功效，可有效消滅細菌營養體、真菌和含脂病毒，但對內孢子無效，對非含脂病毒效果不穩。最有效的濃度是70% (v/v) 和其它藥劑混合，可提昇消毒功效，例如70%酒精加100 g/l甲醛，和70%酒精含2 g/l有效氯。 70%酒精能用於皮膚、實驗桌表面和生物安全操作櫃消毒，也用於浸泡小件手術器材。接觸皮膚時間需超過10秒，接觸環境表面時間要超過3分鐘 醇類為高揮發、易燃，可使橡膠硬化、溶解某些種類的膠。須適當的貯存管理

化學殺菌劑--碘與碘載體(Iodine and iodophors) 可做為外科手術前皮膚的消毒

化學殺菌劑--過氧化氫與超氧酸(Hydrogen peroxide and peracids) 為廣效性殺菌劑，對人類和環境之安全性高於氯 一般市售3%過氧化氫，可立即使用，30%過氧化氫需稀釋5-10倍使用 過氧化氫可用於實驗桌工作區表面、生物安全操作櫃之除污

除污(Decontamination) 小區域的環境除污(Local environmental decontamination)：實驗室空間、實驗室內裝璜和設備的除污，需要使用液態與氣態消毒劑。

除污(Decontamination) 生物安全操作台除污 可用甲醛燻蒸進行除污

熱除污與滅菌(Heat disinfection and sterilization) 160℃高的熱度2-4小時之實驗室器材 燃燒或焚化 高壓高溫滅(Autoclaving)

Prion蛋白的去除 將污染材料浸泡在含4 M quanidinium hydrochloride 或quanidinium isocyanate的2 N NaOH溶液，亦可使用大於2%有效氯的次氯酸鈉溶液處理後，再經132℃高壓高溫處理4.5小時

P2實驗室之防護具使用

BSL分級之安全設施

BSL-2個人安全設施 實驗衣 手套 臉部防護裝置（安全眼鏡）

實驗衣 全程穿著 不宜穿著過於寬鬆之衣服（如領帶，頸巾，頸鍊，手鍊等） 禁止穿拖鞋及涼鞋 蓄長髮者應束紮起來。

手套 手術手套 檢驗手套 橡膠手套 注意穿脫 http://ukhealthnews.blogspot.com/2008/03/nhs-glove-allergy-warning.html

臉部防護裝置 必戴框式眼鏡以保護眼睛，不可只戴隱形眼鏡 http://www.ehsy.com/pic_lib/2005/09/21/Rax-7228.jpg

本系P2實驗室之規範

文件 東吳大學微生物學系P2級教學實驗室管理辦法 東吳大學微生物學系P2級教學實驗室操作規範 東吳大學微生物學系P2級教學實驗室使用申請表 安全檢核表 理學院感染性物質異動單 實驗事故通報單 清潔衛生檢查單（值週） 輪值表

P2級教學實驗室管理辦法 供全系師生研究與教學用，使用生物安全第二級材料者優先 本系專任教師為管理人，並由助教與研究生各一名協助之 鑰匙 定期的清潔工作 物品存放 團體使用者（實驗課程） 意外事故處理

P2級教學實驗室管理辦法 罰則。 未曾參加安全講習、未獲認證而擅自使用者，停止使用權一學期。 擅自複製本實驗室鑰匙者，停止使用權一學期。 未登記而擅取本實驗室鑰匙者，停止使用權四週。 違反本實驗室操作規範者，依照情節之輕重，處以增加清潔維護工作、停止使用權一週至一學期等。

東吳大學微生物學系P2級教學實驗室操作規範 空間使用 本實驗室之使用採預約制度，請使用人於本實驗室門上之時間表上登記使用時間，實驗課程使用者可以預先登記學期之使用時間。 本實驗室鑰匙分別置於助教辦公室與管理人處，屬於實驗課程的團體使用者，請向助教辦公室登記後，領取鑰匙。其他使用者則向管理人登記後，領取鑰匙。 進行實驗時，需關閉實驗室的門窗。 實驗進行中，要在實驗室之入口，掛上「P2級實驗進行中」的標示。 禁止未通過認證以及與實驗無關之人員進入。 實驗室內禁止飲食、吸煙及保存食物。 預防與清除實驗室的非實驗用生物，如昆蟲及鼠類等。 實驗所需一切耗材，應由各使用者自備，內部不得放置與實驗無關的物品（例如書包、外套等），前於試驗結束後將所有實驗物品及廢棄物帶走。 實驗室內部抽屜、櫥櫃主要儲放公用儀器相關零件、工具，各實驗室不得堆置藥品與器材。使用者之材料與器材於實驗期間需要存放於本實驗室者，請向管理人說明，請協助安排放置空間，實驗完畢應即清離。 在此級實驗室內同時進行P1級的實驗時，需明確劃分實驗區域，小心進行操作。 使用完畢後需將電源關閉、門上鎖，歸還鑰匙，方便後續使用者。

東吳大學微生物學系P2級教學實驗室操作規範 實驗操作 必須遵守一般實驗安全操作。 實驗室內，要穿著實驗衣，離開前要脫掉。 不得用口做吸量操作。並應避免使用針頭。操作中，應避免產生氣霧。 應避免將吸管或針筒內之液體用力射出。 與實驗有關之生物材料之廢棄物，在丟棄前需做滅菌處理。被污染的器具需先經高壓滅菌後，或用消毒水清洗。 每天實驗結束後請進行實驗台及生物安全操作台滅菌消毒。 如實驗中發生污染，需立即滅菌，於處理完畢後回報管理人。 操作重組體時需戴手套以防污染，操作完畢後及離開實驗室前需洗手或消毒。 實驗結束離開實驗室前，需脫掉手套後離開。 要從實驗室搬離被污染物品時，必需將其放入堅固且不外漏的容器，並在實驗室內密封之後，才可運出。

東吳大學微生物學系P2級教學實驗室操作規範 儀器使用 儀器使用時請參照儀器旁所張貼之儀器使用辦法，依照規定使用。 使用儀器皆需填寫登記簿，並詳實紀錄使用起迄時間、使用者姓名以及使用時機器狀況。 儀器發生故障時，勿自行拆裝儀器，並請將儀器故障情形，訊速告知管理人。 安全操作裝置內的HEPA過濾器，在更換前、定期檢查時及實驗內容變更時，需密封安全操作裝置，每立方公尺用10公克的甲醛燻蒸1小時，去除污染。 因個人因素所造成之儀器損壞，請由個人或所屬實驗室負擔維修費用。

參考資料 勞委會資料