生物高新技术 在猪用疫苗研发中的应用进展 田克恭 国家兽用药品工程技术研究中心 OIE 猪繁殖与呼吸综合征参考实验室

一直从事动物疫病防控、动物用新型疫苗及诊断试剂的研究与开发 个人基本情况 1988.07 - 2000.08 研究实习员 助理研究员 副研究员/室主任 2000.08 - 2012.10 高级兽医师/诊断检测主任 研究员/诊断检测部主任 研究员/兽医诊断室副主任 研究员/兽医诊断室主任 2012.11 - 至今 研究员/中心主任 国家兽用药品工 程技术研究中心 普莱柯生物工程股份有限公司 一直从事动物疫病防控、动物用新型疫苗及诊断试剂的研究与开发

高致病性猪蓝耳病 2006年春夏之交，我国南方部分省份生猪突然大量死亡 由于病因不明，临床以持续高热为特征，称为猪“高热病”

湖南省临床样品采集登记表 湖南 湘潭 雨湖 09.02 省 市 区 采样 时间 年龄/体重(d/kg) 样品编号 采集的样品 益阳 赫山 2006. 09.01 80/35 HNYYA1 脑、心、肺、肝、脾、肾、淋巴结、扁桃体、血清、 血涂片 60/25 HNYYA2 50/22 HNYYA11 40/15 HNYYB1 脑、心、肺、肝、脾、肾、淋巴结、扁桃体、肠、血清、血涂片 湘潭 雨湖 09.02 30/10 HNXTA1 HNXTA2 脑、心、肺、肝、脾、肾、淋巴结、血清、血涂片 HNXTA3 HNXTA4 经产6胎母猪/260 HNXTA5 心、肺、肝、脾、肾、淋巴结、扁桃体、血清、血涂片 60d/30 HNXTB1

高致病性猪蓝耳病 疫情迅速蔓延至全国大部分省份 生猪价格比上年同期上涨率（%） CPI比上年同期上涨率（%） 8.7% 120.56% 动物保健 食品安全 国民经济 中国是养 猪生产大 国 和 猪 肉 产 品 消 费 大 国，2006 年 生 猪 出 栏 量 超 过 了 6 亿 头， 占世界生猪总出栏量的 50%以上，居 世界首位， 猪肉消费 占中国 肉 类 消 费 的 67%左 右，由 此 可 见，养 猪 业 是 中 国 农 业 的支柱产业，在国民经济中占着重要的地 位。 数据引自国家统计局

（1）首先确诊猪“高热病”的病因，发现并分离到高致病性猪蓝耳病病毒，第一个完成全基因序列测定 第一作者 通讯作者 6

高致病性猪蓝耳病 2008年，农业部将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病 按照党中央、国务院领导批示要求，组织有关单位开展流行病学调查、病原分离鉴定、动物试验等科技攻关，发现了高致病性猪蓝耳病变异病毒，疫情是由高致病性猪蓝耳病病毒引起的，研究制定了相应的防控技术措施

（2）率先研制出疫苗和诊断试剂，及时有效的控制了疫情

（3）专利技术取得了巨大的经济效益和社会效益 直接经济效益 中国专利金奖 核心专利：疫苗产品转让22家企业，技术转让费1.5亿元。 截至2012年，在全国31省以及越南、老挝等东南亚国家推广应用 50.3亿头份，销售额55.6亿元。

高致病性猪蓝耳病病因确诊及关键防控技术研究与应用

高致病性猪蓝耳病—越南、老挝 2007年和2010年，受越南、老挝政府邀请，确诊和控制了疫情 2010年诊断和防控老挝高致病性猪蓝耳病疫情 11

世界动物卫生组织（OIE）猪繁殖与呼吸综合征参考实验室

高新技术在猪用疫苗研发中的应用进展 病毒样颗粒疫苗的研究与开发 猪圆环病毒病（PCV2），口蹄疫（FMD） 基因缺失活疫苗的研究与开发 猪伪狂犬病流行株（PRV）

病毒样颗粒疫苗（VLPs）的特点 不含病毒的遗传物质，安全性好 VLPs 是由病毒衣壳蛋白自主组装而成的空衣壳结构 结构与形态与天然病毒相似 能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，免疫原性好

（1）PCV2病毒样颗粒疫苗 猪圆环病毒2型（PCV2）能够引起免疫抑制，感染引起的相关疫病主要包括仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）等，在我国猪群中PCV2抗体检测阳性率达80%以上，发病率达25%-40%，死淘率10%左右，是目前危害我国乃至世界养猪业的重要疫病之一。

（1） PCV2病毒样颗粒疫苗 国产疫苗：全病毒灭活疫苗：副反应大； 进口疫苗：亚单位疫苗（杆状病毒表达）：价格贵； 新型疫苗：病毒样颗粒疫苗（大肠杆菌表达）：质优价廉。

技术效果 技术路线 PCV2 ORF2基因的扩增 pTO-T7-PCV2 ORF2/BL21工程菌的构建 发酵培养 菌体裂解 硫酸铵分级沉淀 色谱纯化 VLPs组装 免疫原性测定 密码子优化，无标签 可溶性表达 蛋白纯度约20% 蛋白纯度约50%， 去除大部分内毒素 蛋白纯度约96% 组装效率99% 可诱导良好的免疫应答

表达 M 1 2 3 M.Marker 1.诱导前样品 2.诱导后裂解沉淀 3.诱导后裂解上清 Cap蛋白

纯化 M 1 M.Marker 1.纯化后样品 Cap蛋白

VLPs组装过程 Cap蛋白单体 五聚体 5X 病毒样颗粒 12X 组装

（1） PCV2病毒样颗粒疫苗 与进口疫苗相比 1. 抗原更纯！ 2. 抗原含量更高，200μg/头份！ 3. 抗体转阳更早！ 4. 抗体持续时间长！ 进口疫苗 PLK疫苗 Cap蛋白 与进口疫苗相比

（1） PCV2病毒样颗粒疫苗 PCV2 ORF2密码子优化，Cap蛋白实现可溶性表达，空间结构完整，生物活性好，专利保护； 大肠杆菌发酵工艺成熟，菌体产量高，蛋白表达量高（> 30%）； 进口水性佐剂，应激小，反应快，保护力强，安全性高； 一次免疫，一次1ml，真正实现“一生一次一毫升”；

（2）口蹄疫病毒样颗粒疫苗 流行状况：型多（O、A、Asia），面广（猪、牛、羊）； 目前疫苗：全病毒灭活疫苗：副反应大，保护期短； 新型疫苗：颗粒疫苗（大肠杆菌）：质优、价廉、多价。

（2）口蹄疫病毒样颗粒疫苗 VP0 VP2 VP4 FMDV VLPs VP1 VP2 VP3 VP4

（2）口蹄疫病毒样颗粒疫苗 FMDV病毒样颗粒疫苗免疫牛抗体检测结果 动物编号 免前 免21天 免2个月 免3个月 免4个月 免5个月 免6个月 1 ＜1:8 1:360 1:180 1:90 2 3 1:45 1:720 4 5 1:11 6 1:22 ＞1:1024 7 8 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系：抗体效价大于等于1:128，99%保护；效价≤1:16，不保护；效价在1:22-90间，50%保护。

（2）口蹄疫病毒样颗粒疫苗 FMDV病毒样颗粒疫苗免疫牛攻毒保护结果 动物编号 免前 中和抗体 免28天 ELISA抗体 免后 攻毒效检 29 ＜2 1:1440 ＞724 保护 77 1:360 512 1136 ≥23 1:2880 1139 1:180 4 不保护 1580 16 1534 1548 1562 1:90 1567 1:720 431 1576 76 免疫攻毒试验证明，200µg FMDV 病毒样颗粒疫苗效力为12.51 PD50，远高于目前的6 PD50标准。

猪伪狂犬病（PRV）流行株 基因缺失疫苗的研究与开发

我国猪伪狂犬病的流行现状 免疫gE基因缺失活苗，如Bartha-k61 gE抗体检测试剂盒，如IDEXX的gE抗体检测试剂盒 猪伪狂犬病得到有效控制 2011年底 免疫gE基因缺失活疫苗的猪场 gE抗体转阳 猪群部分猪出现发热、厌食，母猪流产、产弱仔，仔猪出生后有神经症状和腹泻，死亡率升高。 种猪场也有部分发病、死亡。

我国原种猪场伪狂犬病毒gE抗体阳性率分布图

PRV流行毒株的致病性显著增强 临床发病猪症状与过去相比明显严重，母猪流产率、仔猪甚至肥猪死亡率显著增加。 30 育肥猪肺部见与高致病性蓝耳病毒引起的相似肺实变，但细看及触摸均可看到灶性坏死性病变；后期在肾脏见到灰白色灶性坏死，排除细菌性感染，则可视为伪狂犬感染示病性病变。 30

现有疫苗对流行毒株不能完全保护 哈尔滨兽医研究所 Bartha-K61免疫后不能完全保护TJ株感染。 上海兽医研究所 6月龄绵羊肌注105TCID50的Bartha-K61，免疫两周后分别感染TJ株和SC株，结果TJ株攻毒后死亡2/3，SC组无死亡。 Bartha-K61免疫后不能完全保护TJ株感染。 上海兽医研究所 用绵羊评价现有疫苗的保护效果 用抗体阳性仔猪评价现有疫苗的保护效果 用抗体阴性仔猪免疫后评价现有疫苗的保护效果 现有疫苗免疫对仔猪可以提供一定的保护（免于死亡），但是不能完全交叉保护（仍有发病）。 抗原基因序列比较 病毒中和试验 结论 结论 抗原变异导致免疫血清中和病毒的能力较差

细菌人工染色体技术（BAC，Bacterial artificial chromosom） PRV 净化 根除 流行株PRV gE基因缺失灭活疫苗 流行株PRV 基因缺失活疫苗

基因缺失活疫苗效力试验（免疫21日后攻毒） gB抗体检测 gE抗体检测 12天--5/5 转阳 21天--2/5转阳 组别 （BioChek） gE抗体检测 （IDEXX） PRV HN1201 基因缺失活疫苗 12天--5/5 转阳 攻毒14天--5/5 阴性 （进口） Bartha-K61 21天--2/5转阳 攻毒14天--3/5 转阳

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