第一章 基因操作的主要技术原理 第二节 凝胶电泳

1 凝胶电泳 凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。

凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。

凝胶电泳的种类 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易

2 核酸电泳 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液， 在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同， 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。

凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小 琼脂糖凝胶： 相对大的孔道，分离大一些的分子； 聚丙烯酰胺凝胶： 很小的孔道，分离小的DNA分子， 能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。

用途 琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序  用途 琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察

电泳的迁移率 取决于核酸分子本身的大小和构型 分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快； 同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。

与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间； 凝胶电泳的分辨力 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间；

Separation Range of Agarose

PolyAcrylamide Gels (PAGE)

2 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖： 一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为 常熔点的琼脂糖 低熔点（LMP）琼脂糖

Agarose gel electrophoresis

LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min

回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液；

琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE, TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间， 小片段高电压短时间

使凝胶中的DNA分子可视化 染色是最简单的方法。 溴乙锭(EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行染色。 注意： 溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。 因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。

染色和观察： 溴化乙锭（EB）染色， 在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪） 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比

DNA分子大小的估计 如何确定凝胶电泳中片段的大小? 最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是： D=a-b (logM) D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。 通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。

方法：利用已知大小的DNA片段作标准(marker /ladder),目的DNA片段与之比对、估计。 例如：HindⅢ将λDNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。 尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5％的错误率

Agarose Gel Electrophoresis Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA kb 12 10 8 6 4 2 1

根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小

Agarose gel electrophoresis

对放射性标记的DNA进行放射性自显影 染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。

3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10％） 缓冲液：TBE

SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 链分离凝胶-SSCP 用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。

核酸测序凝胶 可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）

4 通过凝胶电泳分离染色体 传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。 只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。

脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。

脉冲场凝胶电泳原理图 北 南 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向，DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样 品增加， 制备DNA样品与常规方法 不同

脉冲场凝胶电泳PFGE工作假说 1)    DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr） 2)    DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm） 3)    电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）

与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。

可以分离几千kb的DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。

PFGE can resolve large DNA fragments

染色体DNA电泳的用途 4. 疾病的诊断 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.  疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物Leishmania, 具有其特征性的染色体。PFG便可用于诊断。

5 RNA凝胶电泳 方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。 1.  乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50% DMSO混合 50℃、1 h变性 点样 电泳 染色 观察

2. 羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察

3. 甲醛法 步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上，MOPS缓冲液电泳，染色观察 3.  甲醛法 步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上，MOPS缓冲液电泳，染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳. 4.  三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。

6 蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化） SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。

7 电泳片段的分离与回收 用于DNA、RNA以及蛋白质的回收 方法 1) 电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱到其它介质中； 1) 电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱到其它介质中； 2) 滤纸法 —核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)，电泳至DNA带全部进入滤纸条，洗脱DNA，纯化、沉淀

3) 透析袋法—切下含DNA带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳2-3小时至全部DNA离开凝胶块，反向电泳1分钟，取出DNA液，纯化、沉淀。 4) 冻融法

回收DNA方法 待回收DNA 切口 DNA 切口 凝胶块 滤纸法 透析袋 待回收DNA 透析袋法 V-型槽 电洗脱槽法

影响回收率的因素 1）DNA分子大小—回收率与分子量大小呈负相关； 2）乙醇沉淀—其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关； 3）离心时间—时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。