动物组织石蜡切片制作 科研仪器管理中心
实验目的 制作实验动物的组织切片并染色,掌握动物组织制片技术
实验用品 1.动物的组织。 2.器材和仪器:切片机、展片仪、毛笔、载玻片、盖玻片、烤箱、显微镜。 3.试剂:60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、石蜡、中性树胶。
方案一:病理石蜡切片的制作 (一)石蜡组织块制作 1.取材。 2.固定。 3.脱水、透明及浸蜡(具体步骤见表)。 4.包埋
步 骤 操作项目 小 鼠 大 鼠 家 兔 (1) 60%乙醇 15min 20min 30min (2) 70%乙醇 (3) 80%乙醇 40min (4) 90%乙醇 (5) 95%乙醇Ⅰ (6) 95%乙醇Ⅱ (7) 无水乙醇Ⅰ (8) 无水乙醇Ⅱ (9) 二甲苯Ⅰ 5min 8min 10min (10) 二甲苯Ⅱ 3min (11) 石蜡Ⅰ (12) 石蜡Ⅱ 25min (13) 石蜡Ⅲ
注意事项 一般实质性脏器的组织及肿瘤组织应把最大切面朝下包埋;食管、胃、肠等组织须将管壁横断面朝下包埋,若在同一蜡块中包埋数块管壁组织时,应平行横埋且黏膜面(内膜)的方向应一致,以便切片及观察。 △同一蜡块包埋多个组织块时,组织的性质应相同,方向要一致,不能把大小、厚薄差别悬殊的组织包埋在一起,组织块间的距离不能太大。 △皮肤、骨等难切组织及需要连续切片的组织都应单独包埋。 △神经、脊髓及需要定向包埋的组织应注意组织块的相互关系。 △包埋(尤其在室温较低的情况下)操作应迅速,防止组织块变凉、蜡液凝结及出现气泡,组织块与蜡液不能很好凝固定在一起,导致组织与蜡分离。 △遇有管腔或空洞标本与小标本同埋一个蜡块时,不能将小标本放入其他标本的管腔或空洞内。
(二)石蜡切片制作 用切片机将石蜡包埋的组织块(蜡块)制成适宜厚度的切片,是目前在病理学科中最常用的一种制片方法。切片厚度为一般4~6μm。 【切片前的准备】 1、修切蜡块 切片前应先修块,即切去组织周围过多的石蜡,一般留下约2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄,在切片时易损坏组织;蜡边不能留得太多,否则影响展片。室温过高时,可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。 2、切片用品准备 (1)切片刀:预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一次性切片。 (2)载物片:载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 (3)展片仪:加入温水,接通电源,调整温度。 (4)其他用品:准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。
【切片制作过程】 以使用旋转式切片机石蜡切片为例: 1.将切片刀装在刀架上,后将蜡块装在切片机固定装置上。调整蜡块与刀至合适位置(刀刃与蜡块切面呈5°夹角)旋转式切片机切取组织,是由下向上切,为得到完整的切片,防止组织出现刀纹裂缝,应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织,应将表皮部分向上。而胃肠等组织,应将浆膜面朝上)。 2.左手执手笔,右手旋转切片机旋转轮。先粗切标本,直到暴露出组织最大切面(但对小标本不要修切得太多,以免将整个组织块修切掉)。再连续旋转切出蜡带,左手持毛笔将蜡片带下端轻轻托起,右手用镊子夹起蜡带上端,正面向上放入展片仪水盒内,展片温度根据使用的石蜡熔点进行调整,一般水温为45℃左右,待蜡片带中的组织展平后,即可进行分片和捞片。对于展片困难的切片经30%的乙醇初展后,再用载玻片捞起蜡带放人展片仪水盒内可使切片更易展平。在夏季切片时可用冰块冷却切片刀和组织块,减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热时,使石蜡保持合适的硬度以利于切片。 3.捞起切片后,写上编号。捞片时注意切片的位置,一般切片的中心位于载物片右侧1/3与2/3交界处为佳,并注意整齐美观。 4.烤箱60℃左右烘烤切片30min,对血凝块和皮肤组织应及时烤片,烤片温度应稍低;脑组织切片捞出后直立晾干,再烤片,否则产生气泡。
方案二 石蜡切片的制作 1—6微米。制作大批的或是连续的切片。长期保存。 一、切片前的准备: 1、恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。 方案二 石蜡切片的制作 1—6微米。制作大批的或是连续的切片。长期保存。 一、切片前的准备: 1、恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。 2、蜡块整修,暴露组织并修平,减少刀的磨。 3.载玻片应事先洗涤干净,无油腻和不透明现象。涂粘片剂。 4、将锋利的刀片,调整角度和位置,以20°-30°为佳。 5、备用小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。
方案二 石蜡切片的制作 二、切片的步骤: 1、将蜡块固定于切片机头上的夹座内, 2、调整蜡块组织切面恰好与刀口接触,旋紧刀架 3、根据需要调整切片厚度。 4、修整切片,直到切出完整的最大组织切面后,再行切制。 5、切下的切片带,用毛笔从刀口向上挑起,拉下切片带
方案二 石蜡切片的制作 三、切片的注意事项 1、切片质量的好坏,与技术熟练程度和切片机、切片刀的好坏有关外。 2、切片机的各个零件和螺丝应旋紧,否则将会产生震动。 3、在摇动切片机时,用力要求均匀一致,不宜过重过猛,否则造成切片厚薄不均。或空洞现象。 4、在夏秋季节进行切片时,应使用冰块加强冷却,可保持石蜡的硬度,减少切片的褶皱。
方案二 石蜡切片的制作 四、贴片: 1、将单张切片,用镊子夹住蜡片的一边并提起,铺于恒温水中(光亮的一面朝下)立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。 2、待切片在恒温水内充分摊开展平后,将载玻片垂直插入水中轻靠切片,随即将玻片直立提起,拨正切片位置。 3、用铅笔在玻片的毛玻璃上写上标本编号,字要写得小而清楚、端正。 4、贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时,蛋白质凝固后即可染色。
实验1 石蜡切片的制做技术 试剂与器材:甲醛,酒精,二甲苯,苏木精,伊红,中性树胶,双面刀片,蜡板,镊子,滤纸,200ml容量瓶(广口)、玻璃标本缸,载玻片,盖玻片,染色缸,毛笔,新鲜鸡蛋,甘油 空闲时间:参观冰冻切片的制做 石蜡切片的制做程序(详细过程请查看讲义) 组织取材2毫米厚度,固定于福尔马林2小时。 组织流水冲洗1-2小时。
实验1 石蜡切片的制做技术 70%酒精2-4小时。 85%酒精2-4小时。 95%酒精(Ⅰ)2-3小时。 95%酒精(Ⅱ)1-2小时。 100%酒精(Ⅰ)1-2小时。 100%酒精(Ⅱ)0.5-1小时。 100%酒精:二甲苯(1:1)0.5-1小时。 二甲苯(Ⅰ)20—30分钟。 二甲苯(Ⅱ)10—20分钟。 浸蜡(Ⅰ)40分钟。 浸蜡(Ⅱ)40分钟。 组织包埋。 蜡块整修。切片。贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时。
实验2 HE染色技术 二甲苯Ⅰ脱蜡 10分钟。 二甲苯Ⅱ脱蜡 10分钟。 100%酒精Ⅰ2-5分钟。 100%酒精Ⅱ2-5分钟。 95%酒精1-2分钟。 90%酒精1-2分钟。 85%酒精1-2分钟。 自来水洗 片刻 蒸馏水 片刻 苏木素 10—15分钟 自来水洗 1—2分钟 1%盐酸酒精分化 0.5—1分钟 流水冲洗 蓝化10分钟—至数小时
实验2 HE染色技术 蒸馏水冲洗 1-2分钟。 70%酒精1-2分钟。 85%酒精1-2分钟。 90%酒精1-2分钟。 伊红(醇溶)5-20秒 95%酒精(Ⅰ)1秒 95%酒精(Ⅱ)1秒 100%酒精(Ⅱ)1-2分钟。 100%酒精(Ⅱ)3-5分钟。 二甲苯(Ⅰ)5-10分钟。 二甲苯(Ⅱ)5-10分钟。 中性树胶封片。