肿瘤诊断和预后生物标志物的研究进展 曹志成 院士 William Cho 香港伊利沙伯医院 2010年5月22日

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五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关 Dual-specificity phosphatase 6 (DUSP6), monocyte-to-macrophage differentiation associated protein (MMD), signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (ERBB3), lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK). William Cho 结论 五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关

根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分析非小细胞肺癌患者的生存时间 William Cho 根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分析非小细胞肺癌患者的生存时间 Overall survival and relapse-free survival are shown for the 101 patients with NSCLC (Panel A and Panel B, respectively) and for the 59 patients with stage I or II disease (Panel C and Panel D, respectively). Overall survival is also shown for the independent cohort of 60 patients (Panel E), for the 42 patients in this cohort who had stage I or II disease (Panel F), and for the 86 patients described in an independent set of published NSCLC microarray data10 (Panel G).

70 个预后相关基因表达谱 监督分析 设定为 10%假阴性 70 个与预后显著相关的基因 肿瘤标本 van´t Veer et al., Nature 415, p. 530-536, 2002 70 个与预后显著相关的基因 肿瘤标本 William Cho 设定为 10%假阴性 灵敏性 91 %, 特异性 73% 5

70 个预后相关基因 与肿瘤细胞生物学各个方面均有关 细胞增殖 血管新生 与细胞外基质的黏附 局部侵犯 进入血管内、存活、 外渗 细胞增殖 血管新生 与细胞外基质的黏附 William Cho 未知功能的基因 (25)

独立验证： Buyse et al, JNCI 2006;98:1183-92 307 例 William Cho 7

微阵列试验具有高度的可重复性 (99%) 可重复性：重复试验 Glas et al, BMC Genomics 2007 William Cho Glas et al, BMC Genomics 2007 8

良好预后组患者没有一例复发 MammaPrint: 良好预后组 (n = 23) 不良预后组 (n = 144) William Cho Straver M et al, Brit Cancer Res Treat 2009

16 个肿瘤相关基因 + 5 个参考基因 → Oncotype DX (复发风险指数) 发展高通量、实时RT-PCR技术来定量检测固定肿瘤标本中的基因表达 筛选出250个候选基因 在来自3个临床研究、共447例患者中检测250个候选基因与复发风险的 相关性 已发表的文献 基因组数据库 基于DNA 阵列的实验 William Cho 16 个肿瘤相关基因 + 5 个参考基因 → Oncotype DX (复发风险指数) Paik et al. NEJM. 2004.

如何评估乳腺癌患者的复发风险 基因组学时代的新工具… 传统病理学标准 肿瘤大小 淋巴结状态 Oncotype DX 年龄 肿瘤分期 ER/PR HER2 肿瘤分期 辅助化疗 基于电脑模式 William Cho

细胞增殖 雌激素 Oncotype DX 21-基因复发指数 细胞侵润 参考基因 Ki-67 STK15 Survivin Cyclin B1 MYBL2 雌激素 ER PR Bcl2 SCUBE2 BAG1 GSTM1 CD68 HER2 GRB7 细胞侵润 Stromelysin 3 Cathepsin L2 William Cho 参考基因 Beta-actin GAPDH RPLPO GUS TFRC RS = + 0.47 x HER2 指数 - 0.34 x ER 指数 + 1.04 x 细胞增殖指数 + 0.10 x 细胞侵润指数 + 0.05 x CD68 - 0.08 x GSTM1 - 0.07 x BAG1 Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26

复发指数 复发指数 复发指数 95% C.I. 低危组 RS < 18 复发风险 = 6.8% C.I. = 4.0% - 9.6% 中危组 RS 18 - 31 复发风险 = 14.3% C.I. = 8.3% - 20.3% 高危组 RS  31 复发风险 = 30.5% C.I. = 23.6% - 37.4% 40 35 30 25 20 15 10 5 45 50 复发指数 十年内远处复发转移发生率 William Cho 复发指数 95% C.I. Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26

Oncotype DX 低复发指数（RS）与最小化疗获益相关； 高复发指数（RS）与较好的化疗获益相关。 William Cho

2006年诺贝尔生理学和医学奖 Andrew Z. Fire Craig C. Mello C. elegans William Cho Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2010;1805:209-17 C. elegans

非编码-RNA：曾经被认为是毫无意义的「多余物」 编码蛋白的mRNA 非编码 RNA 转录 调节RNA miRNA siRNA piRNA 反义 RNA 管家 RNAs 核仁小RNAs tRNA rRNA snRNA tmRNA Rnase P RNA vRNAs gRNAs MRP RNA SRP RNAs 端粒酶RNA William Cho 转录/染色体结构调节因子 转录调节因子 蛋白功能调节因子 RNA/蛋白定位调节因子 非编码-RNA在复杂的基因组学中起重要作用

肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱 miRNAs是非编码的小RNA，在调节mRNA的反应和降解中发挥重要作用 先天和后天的转变可能改变miRNA的表达，从而引起肿瘤靶基因的异常表达 Yanaihara et al, Cancer Cell 2006: - 采用miRNA微阵列法对104对原发性肺癌和相应非肿瘤肺部组织的miRNA表达谱做分析 - 43个miRNAs显示出了统计学差异 William Cho

肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱 一项单变量Cox比例风险回归模型全局排列检验显示：miRNA hsa-miR-155 和 hsa-let-7a-2 的表达与腺癌患者的结局相关 hsa-miR-155高表达或hsa-let-7a-2低表达的肺腺癌患者预后较差 William Cho Yanaihara N, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 2006, 9:189-198.

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microRNAs在肿瘤诊断中的作用 应用原位RT-PCR技术，发现miR-221、miR-301和miR-376a 只在胰腺癌细胞中异常表达，但在细胞基质、正常腺泡或 导管中无表达。 异常miRNA表达为胰腺肿瘤形成机制提供新的线索，可能 是胰腺癌诊断的生物标志物。 Lee et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. Int J Cancer 2007;120:1046-1054. Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010. Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2010;1805(2):209-217. William Cho

microRNAs在肿瘤预后中的角色 let-7 miRNA在肺癌中往往表达下降，而let-7 miRNA表达下调与患者术后生存期较短明显相关。 过表达的 let-7 miRNA 在A549肺腺癌细胞中能抑制 体外肺癌细胞的生长。 Takamizawa et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004;64:3753-3756. William Cho

microRNAs在肿瘤预后中的角色 采用miRNA微阵列，比较胰腺癌和正常胰腺组织以及 慢性胰腺炎中miRNA的表达差异： miRNAs表达的差别可以用以鉴别胰腺癌、正常胰腺 组织或/和慢性胰腺炎。 miR-196a-2的高表达能预测患者预后，高表达者往 往活不过24个月。 Bloomston et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis. JAMA 2007;297:1901-1908. William Cho

microRNAs 肿瘤形成 诊断 预后 miR-9 神经母细胞瘤 miR-10b 乳腺癌 miR-15, miR-15a 白血病，垂体瘤 miR-17-5p, miR-17-92 肺癌，淋巴瘤 miR-20a 淋巴瘤，肺癌 miR-21 乳腺癌，胆管癌，头颈肿瘤，白血病 胰腺癌 miR-29, miR-29b 白血病，胆管癌 miR-31 结直肠癌 miR-34a miR-96 miR-98 头颈部肿瘤 miR-103 miR-107 白血病，胰腺癌 miR-125a, miR-125b 神经母细胞瘤，乳腺癌 miR-128 胶质瘤 miR-133b miR-135b miR-143 结肠癌 miR-145 乳腺癌，结直肠癌 miR-146 甲状腺癌 William Cho

microRNAs 肿瘤形成 诊断 预后 miR-155, has-miR-155 乳腺癌，白血病，胰腺癌 肺癌 miR-181, imR-181a, imR-181b, imR-181c 白血病，胶质瘤，甲状腺癌 miR-183 结直肠癌 miR-184 神经母细胞瘤 miR-193 胃癌 miR-196a-2 胰腺癌 miR-221 胶质瘤，甲状腺癌 miR-222 甲状腺癌 miR-223 白血病 miR-301 miR-376 let-7, let-7a, let-7a-1, has-let-7a-2, let-7a-3 肺癌，结肠癌 William Cho Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010. Cho WC. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer 2007;6:60.

基因以外的因素 William Cho 相同的基因组 不同的蛋白组 25

功能性基因组学 基因组学 蛋白组学 在分子水平上描述蛋白和DNA的特性 是理清基因功能的关键 核糖体 蛋白 具有活性的蛋白 DNA mRNA t-RNA 核糖体 (....) 蛋白 CHO PO4 翻译后修饰 X 具有活性的蛋白 基因组学 William Cho 蛋白组学 26

蛋白组学：引领21世纪生物科学 蛋白组学代表着对有机生物、 器官和细胞器中所有蛋白的特 性、分子量、结构和生物化疗、 细胞功能加以明确 蛋白组学代表着对有机生物、 器官和细胞器中所有蛋白的特 性、分子量、结构和生物化疗、 细胞功能加以明确 同时了解这些特性在空间、时 间或不同生理状态下的变化 William Cho Cho WC. Proteomics - leading biological science in the 21st century. Science J 2004;56(5):14-17. Cho and Cheng. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev Proteomics 2007;4(3):401-410. 27

传统方法 vs 高通量技术 William Cho 28

蛋白组学的出现和应用 Cho and Cheng. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev Proteomics 2007;4:401-10. William Cho ESI: 电喷雾电离 MALDI: 基质辅助激光解吸电离 SELDI: 表面增强激光解吸离子化 TOF: 飞行时间 29

表面增强激光解吸离子化 (SELDI) 化学表面 – 蛋白表达谱: 生物表面 – 蛋白相互作用检测: 疏水性 H50 – C9 链 H4 – C16 链 阳离子 WCX2 - 羧酸盐 金属离子亲和层析 金属螯合物 (Cu, Ni, Zn, Ga, Mn, …) 常态 NP20 – SiO2 阴离子 SAX2 – 4O 铵盐 PS-10 or PS-20 蛋白耦合 抗体 – 抗原 受体 – 配体 DNA – 蛋白 生物表面 – 蛋白相互作用检测: William Cho Cho WC. Proteinchip. In: Encyclopedia of Cancer, 2nd Ed. Springer 2009. 30

HTP 自动化 高度可重复的采样程序化流程 蛋白芯片系统 PCS4000 Biomek 2000 (Beckman) William Cho 蛋白芯片系统 PCS4000 Aquarius (Tecan) 31

SELDI-TOF-MS技术 样本分溜、芯片结合和数据获得 Cho WC, et al. Clin Cancer Res 2004;10:43-52. Cho WC. Chin J Biotech 2006;22(6):871-876. Cho WC, et al. J Cell Biochem 2006;99(1):256-68. Cho WC, et al. Dis Markers 2006;22(3):153-66. Cho WC, et al. J Ethnopharmacol 2006;108(2):272-9. Cho WC, et al. Clin Chem 2007;53(2):241-250. William Cho 32

生物标志物的发现 通过比较蛋白图谱可 以容易地找出标志物 SELDI 技术比2D PAGE速度快，可重 复性高 通过比较蛋白图谱可 以容易地找出标志物 SELDI 技术比2D PAGE速度快，可重 复性高 这一技术用以发现多 种疾病的生物标志物， 如卵巢癌、乳腺癌、 前列腺和膀胱癌 (Normal)   (Cancer) William Cho Cho WC. Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery. Mol Cancer 2007;6:25. 33

蛋白质作为生物标志物 蛋白成分可能与机体疾病进展相关，因而可研发成为诊断标志物。 大多数情况下，相对于遗传基因，蛋白与实际疾病进程关系更为密切 蛋白是细胞功能的最终调节因子 大多肿瘤标志物都是蛋白质 绝大多数的药物靶点均为蛋白质 William Cho Cho WC. Cancer biomarkers. In: Methods of Cancer Diagnosis, Therapy and Prognosis. New York: Springer, 5 Jan 2010. 34

鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma) 正常的鼻咽组织 香港人群中第七大常见肿瘤 鼻咽癌临床诊疗中的难题： 1. 诊断时往往已是晚期 (3/4期) 2. 复发常见 (其中>50%是CR的患者) 鼻咽肿瘤 William Cho 肿瘤位于右侧咽鼓管垫 Cho WC. Most common cancers in Asia-Pacific region: nasopharyngeal carcinoma. In: Cancer report of Asian-Pacific region 2010:284-289. 35

蛋白质芯片的应用： 鼻咽癌肿瘤生物标志物的发现 149 例鼻咽癌患者的血样 (未分化型鼻咽癌或分化差的鳞癌） 35 例正常人血样 William Cho 36

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质谱数据采集进行蛋白识别鉴定 1021 1386 1524 854 600 1600 标本 胰蛋白酶消化 2-D 凝胶纯化 质谱分析 (肽图信息) William Cho 识别鉴定 数据库 寻找蛋白 39

MS/MS法识别标志物 34/37离子与 血清淀粉样A配对 William Cho 40

随访生物标志物11,695 Da水平（3例鼻咽癌复发，11例缓解） William Cho Cho WC et al. Clin Cancer Res 2004;10:43-52 41

血清生物标志物在鼻咽癌复发患者化疗前后的改变 EP: Biomarker: 7,659 Da GC: Biomarker: 7,765 Da William Cho EP方案：依托泊苷和顺铂 GC方案：吉西他滨和顺铂 Cho WC et al. ProteinChip array profiling for identification of disease- and chemotherapy-associated biomarkers of nasopharyngeal carcinoma. Clin Chem 2007;53:241-50. 42

卵巢癌的基本数据 患病率 40/100,000 (每2500人里有一个) 每年新诊断患者23,000人 每年死亡人数14,000人 五年总生存率20-30% 75%患者初诊时已是晚期 (III/IV期) I/IIa期治愈率90% 因此，早期发现对提高患者总生存期至关重要 William Cho 43

发现生物标志物的研究设计 多因素模型 获得 独立 确认 交叉 比较 候选 标志物 多因素 模型 蛋白 ID 免疫化验 独立确认 结果: 地区 1 (100) 良性 (50) 对照组 (30) 良性 (90) 对照组 (49) III/IV期 (2) I/II期 (35) 良性 (26) 对照组 63 III/IV期 (103) I/II期 (20) Ca (41) Other Ca 2 (20) 对照组 (41) Other Ca 1 (20) Other Ca 3 (20) 独立 确认 交叉 比较 候选 标志物 地区 2 (176) 地区 3 (164) 地区 4 (63) 地区 5 (142) 多因素 模型 蛋白 ID 免疫化验 独立确认 结果: 描述性数据 两组间 t-检验 表现 ROC曲线分析 多因素模型 获得 发现 1 发现 2 William Cho 44

总体表现 采用蛋白质芯片系统发现第I/II期卵巢癌的生物标志物 五个机构共503个样本 严密的交叉确认和独立确认研究设计 固定特异性 (97%) 三个标志物组 (载脂蛋白 A1、间α胰蛋白酶抑制物 IV和甲状腺素运 载蛋白)：敏感性74% CA125：敏感性65% 固定敏感性 (83%) 三个标志物组：特异性94% CA125：特异性54% William Cho 45

多标志物研究的开拓 Peak A Criteria Peak B Criteria Peak C Criteria 肿瘤 正常 确认各个生物标志物的身份, 与相应的疾病生物学相联系 敏感性 “真阳性” 特异性 “真阴性” 单个标志物 65% 35% 生物标志物模式 >90% William Cho 46

FDA于2009年9月11日批准了OVA1 试验 将生物标志物的发现从实验室开拓到临床应用中 基于一项前瞻性双盲的临床研究，纳入27个机构共 516例患者 269 例患者只根据手术前信息进行评估 247 例患者根据手术前信息和OVA1结果进行评估 OVA1 检测能识别出额外的潜在恶性肿瘤患者 有助于指导手术决策 William Cho

OVA1 首个FDA获准的基于蛋白水平的体外诊断多因素指 数检测 首个FDA获准的用于卵巢癌术前和术后的预后检测 在血标本中检测 5 个蛋白 SELDI技术筛选出β2-微球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白 A1、 甲状腺素运载蛋白 CA125 预测良恶性可能 William Cho

Scientific American William Cho Cho WC. Proteomic approaches to cancer target identification. Drug Discov Today: Ther Strategies 2007;4(4):245-250. 49

肿瘤治疗靶点 1 2 5 4 7 3 6 7 12 7 8 9 11 10 基因转录 DNA 复制和修复 细胞膜 微管动力学 生长因子 P 2 5 4 细胞膜 3 6 7 7 微管动力学 1. 生长因子 2. 生长因子受体 3. 连接蛋白 4. 停靠蛋白/结合蛋白 5. 鸟嘌呤核苷酸交换因子 6. 磷酸酶和磷酸酯酶 7. 信号激酶 8. 核糖体 9. 转录因子 10. 组蛋白 11. DNA 12. 微管 PDK1,2 12 生长因子 信号通路 RNA 转录 7 8 细胞核膜 9 11 10 基因转录 DNA 复制和修复 细胞生长 运动性 细胞存活 细胞增殖 血管新生 50

结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效 Mutant KRAS +EGFR -EGFR Wild type KRAS Amado et al. J Clin Oncol; 26:1626-1634 2008 William Cho 51 51

结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效 PIK3CA 突变率: 13% Mutant KRAS +EGFR -EGFR Wild type KRAS Amado et al. J Clin Oncol 2008;26:1626-34 BRAF突变率: 10% William Cho 52 52

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Rx Rx → 传统肿瘤治疗: 个体化肿瘤治疗: 治疗: 信号通路靶向治疗 Dx 诊断 分期、分级、 免疫组织化学检验 治疗 化疗 William Cho 诊断 分期、分级、 免疫组织化学检验 治疗 化疗

结肠癌中PI3K信号途径的159个基因指纹 William Cho 55

信号通路和网络分析 William Cho Cho WC. Proteomics technologies and challenges. Genomics Proteomics Bioinformatics 2007;5(2):77-85. 56

William Cho Cho WC (ed). An omics perspective on cancer research. New York: Springer 2010. 57

E-mail: chocs@ha.org.hk 谢 谢 William Cho E-mail: chocs@ha.org.hk