基因传递系统 Gene Delivery Systems 张娜

Main Contents 1. Introduction 2. Delivery systems (1) viral vector (2) non-viral vector

Introduction 基因治疗 (gene therapy) 依靠人源或外源的遗传物质 , 来纠正人类基因的结构或功能上的错乱 , 阻止病变的发展 , 杀灭病变的细胞 , 或抑制外源病原体遗传物质的复制 , 从而实现对疾病的治疗 。

Gene therapy 基因治疗分为二种不同的途径 。 Ex vivo 途径:将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞 ,经体外细胞扩增后 ,再输入人体。 In vivo途径:将外源基因装配于适宜的载体传递系统 ,直接输入人体 。

Introduction 基因治疗的成功与否主要涉及三个重要环节。 首先要有用于治疗的基因 ( 目的基因 ), 其次要有接受目的基因的细胞 ( 靶细胞 ), 最后要有一个适宜的传递系统 ( 导入系统 ) 将目的基因输送至靶细胞。 基因治疗正是围绕这三个技术关键点来展开深入研究的。

目的基因 1.随着人类基因组计划的完成 , 人们可以获得一套正版人类基因的版本 , 一方面将有利于查找病变基因 , 一方面可以通过人工合成方式 , 按标准版本制造出需要的目的基 因。 2.目前用于基因治疗的目的基因并不太多 , 大约有 10 多个不同类别的基因 90 余 种 。 3.人类对大部分的多基因疾病 , 如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病等的致病基因还不是很了解 ,有待阐明。

靶细胞 皮肤成纤维细胞 肝细胞 内皮细胞 淋巴细胞 缺点：转入基因表达量少 且不能持续表达 目前靶细胞

靶细胞 骨髓造血干细胞可不断分化 ,能将目的基因传递给子代细胞 ,因而成为十分重要的靶细胞； 未来的靶细胞除了上述体细胞外 , 还可能是生殖细胞 , 这样才可能真正取代缺陷基因 , 使之不会遗传给下一代。

Delivery systems 目的基因被输送至靶细胞后 , 一般是通过内吞方式进入细胞 , 并存在于内吞小泡 (endosome) 中 , 内吞小泡可以将内容物释放至溶酶体中 , 后者有丰富的酶系统 , 可使 DNA 降解破坏。 目的基因必须从内吞小泡释放进入胞浆 , 并最终进入细胞核中才能实现基因的表达

Delivery systems 基因治疗中最关键的技术就是基因的输送或传递 。 载体在输送基因的过程中要遇到二个主要的障碍： 一个是胞外屏障 , 指载体进入机体到达靶细胞之前所遇到的障碍 ,包括降解酶系统 、吞噬系统 、调理化作用和胞外粘膜层等 ； 另一个是胞内屏障 ,包括靶细胞膜、内吞小泡和细胞核膜等。

载体 / DNA 复合 物 另外 , 用于基因治疗的 DNA 为超螺旋结构或开环结构 ,空间体积很大 ,一般难以主动或有效地进入靶细胞。 通过与适当载体的结合 ,DNA 的体积可以变为原来的 1% 以下 , 这个过程称为缩合 (condensation) 。 缩合可形成具高级有序结构的载体 / DNA 复合 物 , 有利于 DNA 对靶细胞的透入 , 从而提高转染的效率。

控制基因的释放 , 延长基因的表达时间 ,改善基因治疗的效果 二、基因的传递系统 一个理想的基因传递系统应具备以下重要的性质 : ①携带性能 对机体没有毒性 、致病性或免疫原性 , 具有生物降解性或良好的生物相容性 控制基因的释放 , 延长基因的表达时间 ,改善基因治疗的效果 ②安全性 能携带足够数量的目的基因 ③缓释作用

理想的基因传递系统 ④稳定性 载体系统本身应稳定 , 而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏 ⑤靶向性能 可有效地将目的基因输送至靶细胞内

理想的基因传递系统 ⑥可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆 ； ⑦可促进目的基因转运入核； ⑧可调控基因输入后在体内的表达 ,因为表达失控的后果将是非常严重的。

发展概况 从 1990 年 FDA 正式批准基因治疗进行临床试验以来 , 基因治疗经历了狂热期 (1990～1995) 和理性期 (1996～ 现在 ) 。 迄今为止已有 380 多个治疗方案进入临床 , 病例数达 3 000多人。 在这些治疗方案中 , 针对恶性肿瘤的最多， 然后依次为 HIV 和遗传病等。

Delivery systems 在已进行的基因传递系统的临床研究中 , 反转录病毒传递系统占首位 , 共计 150多个治疗方案 , 病例数达 1200 多人 ； 脂质体传递系统位于第二 , 治疗方案 70 多个 , 病 例数达 700 多人 ; 腺病毒传递系统位于第三 , 治疗方案约 70 个 , 病例数达 400 多人 ; 排在后面的基因传递系统依次是产生反转录病毒的包装细胞 、 Pox 病毒、 DNA 载体和腺相关病毒。

( 一 ) 病毒基因传递系统 病毒基因传递系统也称病毒载体 (viral vector), 是野生型病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统 其主要特点是转染相对高效 , 但安全性较差。

病毒结构 病毒一般由核酸和蛋白质外壳构成。 病毒基因组可分为编码区与非编码区 , 编码区基因可表达病毒的结构蛋白和非结构蛋白； 编码区基因又分为必需基因和非必需基因 , 必需基因负责病毒感染性能复制 ; 非编码区包含病毒复制与包装所必需的顺式作用元件。

制备病毒基因传递系统的方法 1.删除病毒的某些必需基因,用外源基因 ( 目的基因 ) 代替病毒的非必需基因 ( 非编码区不变 ) 特点：一方面病毒成为复制缺陷型病毒 , 另一方面也为外源基因留出了空间。

制备病毒基因传递系统的方法 2.重组载体质粒 外源基因 、顺式作用元件和质粒骨架 在辅助系统 ( 反式作用元件 ) 的作用下包装到病毒壳粒中,形成重组载体质粒 。 特点： 不含任何病毒基因 , 但在包装时需要辅助病毒参与 , 容易造成产品污染。

目前可选择的病毒载体 反转录病毒（Retrovirus） 腺病毒(Adenovirus) 腺相关病毒 疱疹病毒 甲病毒

病毒基因传递系统的组装

病毒基因传递系统

病毒基因传递系统的转染

腺病毒－逆转录病毒在位形成复合物

( 二 ) 非病毒基因传递系统 非病毒基因传递系统也称非病毒载体 (non-viral vector), 可以克服病毒载体的很多缺陷 , 己越来越引起科学家的重视。 目前已进入临床研究的主要是阳离子脂质体和 DNA 载体。 非病毒基因传递系统的主要特点是安全性好 , 但转染相对低效。

DNA 载体 DNA 载体又称质粒 DNA (plasmid DNA) 或裸 DNA (naked DNA), 可能是最简单的非病毒传递系统。 用于基因治疗的质粒 DNA 产品与一般的药品很类似 , 需要有一定的剂型和质量标准。 纯化质粒 DNA 的安全性较好 , 不会引起炎症反应等 , 适用面也较广 , 剂量可以因人而异。

DNA 载体 质粒 DNA 在靶细胞中的表达效率较低 , 持续时间较短 , 因此需要的剂量比较大。

质粒DNA的转染

脂质体载体 阳离子脂质体 阴离子脂质体 pH 敏感型脂质体 融合脂质体 用脂质体作为载体进行基因输送的研究已有 20 多年 , 这是因为脂质体可促进大分子物质对细胞膜的穿透。 阳离子脂质体 阴离子脂质体 pH 敏感型脂质体 融合脂质体

阳离子脂质体 阳离子脂质体 (cationic liposomes) 是基因治疗中应用最多的非病毒传递系统 一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定的摩尔比组成。

阳离子脂类 用于制备阳离子脂质体的阳离子脂类大多是合成的双链季铵盐型两性分子 主要作用就是提供正电荷，增加与 DNA 的缩合 一般化学稳定性较好 ,可以生物降解 ,但均有一定的细胞毒性。

中性脂类 胆固醇 (Chol) 磷酯酰胆碱 (PC) 磷酯酰乙醇胺 (PE) 二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC) 中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。 胆固醇 (Chol) 磷酯酰胆碱 (PC) 磷酯酰乙醇胺 (PE) 二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC) 二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)

Cationic lipid based DNA delivery system

阳离子脂质体的转染效率影响因素 1. 粒径 内吞小泡的大小约在 80～200 n m 之间 , 因此内吞作用是一个体积限制性步骤 , 这就要求所制备的阳离子脂质体大小适宜 , 而且复合物也应足够小 , 或者说缩合应比较完全；

1. 粒径 由于复合物的形成是一个自发的过程 ,控制起来有一定难度 , 而且复合物还可能进一步聚集 , 因此一般是将脂质体 和 DNA 分别包装 , 临用时再进行混合 ；

2.稳定性 阳离子脂质体在血液循环中的稳定性是一个重要的问题 , 阳离子脂质体在血液循环中会带上负电荷 , 而且容易发生聚集或破裂 , 释放出 DNA , 用聚乙二醇等进行修饰可在一定程度上降低复合物与血液成份的相互作用。

1.具有多个正电荷头部的脂质体转染效率高 ,可能是与 DNA 作用更牢、缩合较好有关； 2.DOPE 具有很强的细胞膜去稳定化作用 , 可以提高 DNA 的转染效率 , 随着 DOPE 比例增加 , 转染效率随之提高 , 但脂质体在血中的稳定性也会下降。

商品化阳离子脂质体 1. Lipofectin 和 Lipofect AMINE, 分别由 阳离子脂质 DOTMA 、 DOSPA 与中性脂质 DOPE 构成 。 2.DC-Chol/DOPE 脂质体是第一个被批准用于人体临床试验的阳离子脂质体

(2) 阴离子脂质体 阴离子脂质体 (anionic liposomes ) 所用的阴离子脂质包括磷酯酰丝氨酸、心肌磷脂和二棕榈磷脂酰甘油等。 由于载体与 DNA 都带负电 , 为了提高包封效率常需在制备脂质体时加入钙。 阴离子脂质体的特点是可将低聚核苷酸定位于细胞核 , 而且可延长低聚核苷酸在细胞内的保留时间。 对阴离子脂质体的研究还比较少。

(3)pH 敏感型脂质体 PH敏感脂质体(pH-sensitive liposomes)是一种具有细胞内靶向和 控制药物(如基因、肽、蛋白质)释放的 功能性脂质体。

pH 敏感型脂质体膜融合机制 1.在酸性条件下，即在核内体形成后几分钟内，进入溶酶体之前，pH从7.4减至5.3～6.3左右时，可导致脂肪酯羧基的质子化，而引起六角晶相的形成， 2.pH敏感脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合， 3.将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除。

(3)pH 敏感型脂质体 pH 敏感型脂质体 可由 DOPE 、 Chol 和油酸以 4:4:2 的摩尔比组成。

(4) 融合脂质体 融合脂质体 ( fusogenic liposomes) 是在制备脂质体时加入融合剂而获得。 常用融合剂包括 PEG 、甘油 、 PVA 、以及重组病毒的细胞膜或某些病毒蛋白。 DOPE 也具有融合剂的性质 , 主要用于阳离子脂质体 /DNA 复合物的制备 。 目前应用还比较少。

3. 阳离子聚合物 阳离子聚合物 (cationic polymer) 与 DNA 可以在电荷作用下发生缩合 , 形成稳定的复合物 , 防止 DNA 的降解 , 其大小可在 100 n m 以下 , 表面带正电 , 有利于与靶细胞的 吸附。 这类载体的安全性较好 , 容易制备 , 不足之处是缺乏靶向性 , 而且单独应用时转染效率比较低。

3. 阳离子聚合物 可选择的阳离子聚合物 聚氨基化合物 聚氨基酸 星状树突体

阳离子聚合物基因载体

聚乙烯亚胺 (PEI) PEI是一种比较常用的阳离子聚合物 具有高度分枝的结构, 内部的氨基与末端的氨基可在不同的 pH 下离子化, 有较强的缓冲性能

PEI PEI有较强的缓冲性能 一方面有利于 DNA 的稳定性 , 另一方面,PEI 在酸性条件下构象改变

星状树突体 星状树突体 (starburst dendrimeers) 的核心分子至少有三个具化学活性的侧链 , 在这些化学活性部位与其他同样的分子聚合 , 如此反复 , 产生一个类似球型的分枝状聚合物。 典型的星状树突体是聚氨基酰胺 (polyamidoamine) 。

星状树突体 星状树突体的聚合过程是可以 控制的 , 因此可以获得不同粒度大小的产物。这类载体用于体外实验已很成功 目前正在研制可生物降解的 , 或者可形成圆筒状的星状树突体。 由于具有分枝结构 , 星状树突体也具缓冲性能 , 可促进 DNA 从内吞小泡中释放。

聚氨基酸 虽然有 4 种带正电的氨基酸 , 但用于基因输送的聚氨基酸几乎只有聚赖氨酸 而且 在 20 世纪60年代就已有文献报道。 聚氨基酸 /DNA 复合物缺乏靶向性 , 而且由于是线性的结构 , 不能促进复合物从内吞小泡中释放 DNA, 因此往往需要进行一些修饰以改善其性能。

修饰的聚赖氨酸基因载体

4. 纳米粒载体 纳米粒传输系统具有前述理想的基因传递系统具备的很多重要性质 ,特别是安全性、稳定性和缓释作用明显。 进行适当修饰后可提高其靶向性和转染效率。目前应用较多的制备纳米粒的材料有明胶 、壳聚糖和 LGUA 等。

5. 非病毒基因输送系统的优化 可以说到目前为止 ,所有的非病毒基因输送系统都并不十分理想 , 总有一些不足之处 , 需要进行优化与完善。 1.在提高靶向性方面 , 常用的方法是受体介导或抗体介导的方法

受体介导的基因载体

5. 非病毒基因输送系统的优化 2.促进 DNA 从内吞小泡中释放 3.促进 DNA 的转运入核 4.载体输送系统中基因的表达 5.安全性 6.各种载体与各种修饰方法进行组合

复习题 1 . 基因治疗的概念 2 . 基因治疗主要涉及的三个重要环节 3 . 基因治疗的常用载体