微生物学实验 海南大学海洋学院

实验一 细菌的形态和结构观察

一、实验目的 观察细菌的菌落特征 掌握简单染色法和细菌涂片方法 在油镜下观察细菌个体的形态特征

二、实验的基本原理 形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年 还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基 成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地 颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细 胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体 形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型：简单染色、 鉴别染色、特殊染色。

二、实验的基本原理 简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电 荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、 结晶紫等进行染色。 采用加热或化学固定两种方法，使菌体粘附于 玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力

三、 实验材料 显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 三、 实验材料 显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 0.05% 和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，0.5%番红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水 细菌三种形态的染色标本。 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳链球菌24h液体培养基培养物 盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。

四、实验步骤 简单染色法（一般染色法） １.菌种：牙垢细菌 ２.涂片 ３.干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。 ４ 固定 ５.染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟 。 ６.水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。 ７干燥：空气中自然干燥。８ 镜检：在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。

四、实验步骤 油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

四、实验步骤 显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

四、实验步骤 细菌三种基本形态的观察： 菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。 1. 结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。 2. 看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。

思 考 题 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

实验二 细菌的革兰氏染色

一、实验目的 掌握细菌的革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造

二、实验的基本原理 细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色 有不同的反应（阳性和阴性）： 革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度 低，当以95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变 大，肽聚糖因95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量 较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复 合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成 红色； 革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经 95%酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得 结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被95%酒精洗脱出细胞壁 之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。

三、实验材料 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯， 双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。 染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏(Lugol) 碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。 菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌24h普通海水琼脂斜面28℃培 养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌24h牛肉膏琼脂斜面 28℃培养物。

四、实验步骤 革兰氏（Gram）染色法 1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。

思　考　题 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？

实验三 实验室环境及人体表面的 微生物检查

一、实验目的 认识细菌分布的广泛性； 掌握对菌落识别； 懂得无菌操作的重要性。

二、实验的基本原理 每一菌体在适宜条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉 眼可见的子细胞集合体，称为菌落。 由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不 同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现 其固有的特点。 通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养 基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中 及人体细菌的数量和类型。

三、实验材料 无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭子等。 琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，2％碘酒，75％乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革兰氏染色剂。 水样，泥土，空气和人体。

四、实验步骤 1、正常人体的细菌检查 皮肤细菌的检查 （1）将手指在平板上按一下；取一根头发，用无菌镊子贴放在平板上。 （2）平板培养、观察

四、实验步骤 咽部细菌的检查 （1）用无菌棉拭子蘸取咽部分泌的液体，然后将该棉拭子在血琼脂平板一端涂抹，接下来用接种环以涂抹处为起点，在平板上画之字形图案进行分离。 （2）将血琼脂平板置37℃培养箱中，培养18～24h，挑选不同菌落作革兰氏染色，镜检。

四、实验步骤 牙垢中细菌的检查 （1）用消毒牙签剔牙垢少许，置于玻片中央。 （2）加少许生理盐水将牙垢混匀，涂成薄层，用酒精灯干燥固定。 （3）革兰氏染色，镜捡。

四、实验步骤 2、空气中细菌的检查 （1）取4个无菌操作制备的琼脂平板，将3个分别置于实验台、走廊、窗台等位置，并打开皿盖放置15～30min后，盖好皿盖；另外1个不打开皿盖作为对照。 （2）将上述4个琼脂平板置37℃培养箱中培养18～24h。

四、实验步骤 3. 水中细菌的检查 （1）十倍梯度稀释 （2）稀释水样与培养基混合倒平板 （3）培养、观察。

思　考　题 对各种来源的样品进行对比，如平板菌落数和菌落类型等？ 饭前为何要洗手？ 如何防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面？

实 验 四 培养基的配制与灭菌

一、实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。

二、实验的基本原理 培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。

三、实验材料 (1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液、琼脂、水 (2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、烘箱。

四、实验步骤 一、玻璃器皿的洗涤和包装 2-1棉塞制作方法 2-2移液管灭菌前的包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法 2-2移液管灭菌前的包装

二、培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。

3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.2~7.4，用精密pH试纸 对照。 4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱 布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基 ，该步可省略。 5. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL 锥形瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基 沾在管口或瓶口上面造成污染(见图2－3)。分装量：固体 培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面（图2－4） 。分装入锥形瓶内以不超过其容积的3/5为宜。半固体培 养基以试管高度的1/3为宜．灭菌后垂直待凝。注意不要 污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 7. 灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力0.103MPa ）培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生 长，方可使用。

图 例 图2－3培养基分装 图2－4 斜面制作

三、稀释水的制备 1.取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 2.另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。

四、灭菌 加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160℃并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，才能将物品取出。

湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。

5. 当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121℃)即开始灭菌，使其维持15～30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。

间歇灭菌法： 即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。 操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，连续3d重复进行。 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37℃恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在 37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。

过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。 用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器

思 考 题 1.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 思　考　题 1.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无菌检查？ 3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?

实验五 细菌纯种分离、培养和接种技术

一、实验目的 1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。 2.掌握几种接种技术。

二、实验材料 无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2支、10mL1支。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。

三、实验步骤 一、细菌的纯种分离

(一)稀释平板法 1. 取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。 2. 稀释水样 将1瓶90mL和5管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上10－1、 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样(或其它样品)加入编号为10－1无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10－1浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取1mL 10－1浓度的菌液于编号为10－2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10－6 。

10mL试样 90mL蒸馏水 稀释液的制备

3. 平板的制作 ① 取10套无菌培养皿编号， 10－4、10－5、10－6各3个，另一个为空气对照。 ② 取1支1mL无菌移液管从浓度小的菌液开始，以10－6、10－5、10－4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。

③ 加热培养基，当其冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。 a:皿法 b:倒平板

④ 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。

（二）平板划线法 1. 平板制作：将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。 2. 划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)。划线完毕盖好皿盖，30℃培养24～48h后观察结果。

平板划线分离的划线方法 左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线的起点）

二、细菌的接种技术 接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。

（一）斜面接种法 ① 左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面(两支试管的斜面同时向上) 。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 ② 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 ③ 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。 1 2 3

④ 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。 5 4 6 7 8

（二）液体接种和穿刺接种 1.液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。 2.穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。

（三）稀释平板涂布法 1.稀释样品：方法同稀释平板分离法 2.倒平板：将融化并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板 3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀 4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。

（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基 接种工具：无菌移液管和无菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。

思 考 题 1. 斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？ 思　考　题 1. 斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？ 2.用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？

实验六 微生物细胞的计数

一、实验目的 1.了解血球计数板的结构及计数原理。 2、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验的基本原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。 显微镜直接计数法 将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

血球计数板的构造

血球计数板的计算方法 血球计数板上刻有一长宽各为1毫米的方形大格，其体积为0.1mm3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为16个中格，而每中格又分25个小格，每大格为16×25小格=400小格，而另一种，则是每大格分为25个中格，而每中格又分为16个小格，则每大格为25×16=400小格（计数板上的标识为XB·K25） 计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果使用25 格× 16格规格的计数室除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。 (6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下方和右方线上的酵母细胞)。

计数公式 (1)16×25的血球计数板计算公式： 酵母细胞数／ml=（100小格内酵母细胞个数／ 100）×400×10000×稀释倍数 (2)25x16的血球计数板计算公式： 酵母细胞数／ml=（80小格内酵母细胞个数／80）×400×10000×稀释倍数

三、实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。

操作步骤 1. 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 1. 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 2. 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。 3. 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 25个中格的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复计2-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。 4.清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。

结果记录 第一个 中格 第二个 第三个 第四个 第五个 第一次 测 定 第二次 第三次 平 均

思　考　题 1.使用血球计数板应注意什么问题? 2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施

实验七 大肠杆菌生长曲线的测定

一、实验目的 1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线； 2. 学习光电比浊法测量细菌数量的方法。

二、实验的基本原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养 基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养 液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间 作横坐标，所绘制的曲线叫生长曲线。它反映了 单细胞微生物在一定环境条件下进行液体培养时 所表现出的群体生长规律。 细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此 可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌 液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间 作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，

三、实验材料 722型分光光度计，恒温振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。 LB液体培养基。 大肠杆菌。

四、实验步骤 1. 250mL三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。 2.大肠杆菌接入盛有50mL LB液体培养基振荡培养。 3. 分别按对应时间将三角瓶取出，立即于4℃条件下贮存，待所有培养结束时一同测定OD值。

四、实验步骤 4. 将未接种的LB液体培养基倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的LB液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

思 考 题 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点？ 思　考　题 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点？ 次生礼谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?

实验八 细菌的生理生化反应 ——大分子物质的水解试验

一、实验目的 1、证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3、了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5、了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

二、实验的基本原理 1、微生物对生物大分子的分解利用 淀粉水解：淀粉酶 2、糖发酵试验 油脂水解：脂肪酶 明胶液化：蛋白酶 石蕊牛乳试验：产酸、产碱、胨化、酸凝固等。 2、糖发酵试验 产酸：溴甲酚紫指示剂 大肠杆菌： 产气肠杆菌： 产气：杜氏小管检测 3、IMViC试验

IMViC试验 吲哚试验： 甲基红试验（M.R.试验）： 伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验）： 柠檬酸盐试验： 色氨酸酶：色氨酸→吲哚＋对二甲基氨基苯甲醛→玫瑰吲哚（红色） 大肠杆菌： 产气肠杆菌： 产酸能力：强，甲基红变红；弱：甲基红不变色 大肠杆菌：阳性 产气肠杆菌：阴性 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2,3-丁二醇 乙酰甲基甲醇→OH－→二乙酰＋精氨酸的胍基→红色化合物 大肠杆菌：阳性 产气肠杆菌：阴性 能否利用柠檬酸作为碳源 大肠杆菌：阴性 产气肠杆菌：阳性

三、实验材料 1、菌种：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），普通变形杆菌（Proteus vularis），产气肠杆菌。 2、培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，普通变形杆菌（内装有倒置的德汉氏小管） ，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。 3、溶液或试剂：革兰氏染色用卢氏碘液（Lugol’s iodine solution），甲基红指示剂，40% KOH，5% α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。 4、仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。

四、实验步骤 1、细菌水解大分子物质试验 淀粉水解试验 油脂水解试验 培养基：淀粉培养基平板 菌种：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 明胶液化试验 方法：平板上划“十”字接种 注意：接种前在平板底部作记号；“十”字不要太大 明胶液化试验 培养基：油脂培养基平板 菌种：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 方法：平板上划折线接种 注意：接种前在平板底部作记号 石蕊牛乳试验 培养基：试管明胶培养基 菌种：大肠杆菌或 产气肠杆菌 方法：穿刺接种 注意：20℃培养 培养基：试管石蕊牛乳培养基（2支） 菌种：粘乳产碱菌或铜绿假单胞菌 方法：斜面划线接种 注意：观察结构注意牛乳产酸、产碱、凝固、胨化现象是连续出现的。

四、实验步骤 1、细菌水解大分子物质试验 2、糖发酵试验 培养基：葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基（内装杜氏小管）（各3支） 菌种：大肠杆菌和产气肠杆菌 方法：分别接种于葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基

四、实验步骤 1、细菌水解大分子物质试验 2、糖发酵试验 3、IMViC试验

IMViC试验 试验名称 培养基名称 菌种名称 接种方式 接种 管数 吲哚试验 蛋白胨水培养基 大肠杆菌和产气肠杆菌 液体 1 甲基红试验 葡萄糖蛋白胨培养基 伏普试验 柠檬酸盐试验 柠檬酸盐培养基 斜面

思 考 题 1、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？ 2、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？ 思　考　题 1、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？ 2、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？ 3、为什么大肠杆菌的甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同之处？ 4、说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？

实验九 菌种的保藏

一、实验目的 1. 学习和掌握菌种保藏的基本原理; 2. 比较和掌握几种不同菌种保藏的方法。

二、实验的基本原理 微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，被其他杂菌污染，甚至导致细胞死亡，因此，菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都很重要，也是非常必要的。人为地创造低温、缺氧、干燥、缺少营养物质等不良条件，抑制微生物的生长、繁殖，使其处于休眠状态，从而可以较长时间保持菌种不死亡和不变异。

二、实验的基本原理 几种常用的保藏方法： 1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。 2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。

二、实验的基本原理 3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。 5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。 L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。

三、实验材料 试管，棉塞，研体，烧杯，pH试纸，干燥器，高压灭菌锅，干燥箱，培养箱，真空泵，接种针，超净工作台，酒精灯，火柴，冻存管，安瓿管，吸管。 甘油，液体石蜡，干冰，培养基等。 哈氏弧菌。

四、实验步骤 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充 分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成 胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌 及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个 月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏 时间短、易被污染。

四、实验步骤 2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。

四、实验步骤 4、砂土管保藏法 （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理　 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。

(4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使 用。 (5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。 (6)分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入0．5ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)， 用接种针拌匀。 (7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。 (8)保存 置4℃冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、 效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。

四、实验步骤 5、冷冻真空干燥法 （1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。 （2）菌种培养：细菌芽孢脱落；放，霉孢子丰满。 （3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查 （4）菌悬液的制备：2-3ml保护剂 （5）分装样品：菌悬液每管0.2ml （6）预冻：程序控温仪降温 （7）冷冻真空干燥：-50℃下抽真空 （8）取出样品：轻敲松散即达标 （9）第二次干燥： （10）熔封 （11）存活性检测：抽取一管进行存活性检查 （12）保存：4℃保存

思 考 题 1、液体石蜡保藏菌种的原理是什么？ 2、 产孢子的菌种一般用哪一种方法保藏？ 3、细菌用哪种方法保存的时间长面又不易变异？ 思　考　题 1、液体石蜡保藏菌种的原理是什么？ 2、 产孢子的菌种一般用哪一种方法保藏？ 3、细菌用哪种方法保存的时间长面又不易变异？ 4、经常使用的细菌菌种，应用哪一种方法保藏既好又简便？

实验十 海水养殖池塘水体中各类细菌总数的测定

一、实验目的 1.学习水样的采取方法和各类水样细菌总数测定的方法； 2.了解水样的平板菌落计数的原则。

二、实验的基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中各类细菌的总数。 由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出水中各类细菌总数仅是一种近似值。

三、实验材料 灭菌的平皿(90cm)，灭菌的刻度吸管(l.0 mL， 1.0mL)，盛9.0mL无菌水的试管，恒温培养箱等。 培养基： 2216E培养基；TCBS培养基(弧菌用)；. 放线菌培养基； 氨化细菌培养基； 亚硝化细菌 富集培养基； 硝化细菌富集培养基 海水养殖池塘（虾池或鱼池）水样。

四、实验步骤 1.水体取样： 应取距水面10～15cm的深层水样。先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。

四、实验步骤 3. 将水样分别稀释成10-1、10-2、10-3三个连续稀释浓度（注意：在稀释前后一定要充分混匀）。 注意：水样的稀释，取1个灭菌空试管，加入9mL灭菌水。用取过灭菌水的移液管取1mL河水样，放入试管中，振荡试管混合均匀。

四、实验步骤 4.涂布平板法： 1.加热已经配制好的固体培养基（肉膏蛋白胨琼脂培养基），使固体培养基溶化。 2.倒制平板：每个空平皿中倒约20mL的培养基，放置桌面待其凝固。 3.用移液管吸取0.1mL水样，滴于平板中；将玻璃涂布棒于酒精灯的外焰上加热，杀死表面微生物，然后耐心待其冷却，然后用涂布棒将水滴均匀的涂满整个平板表面，尽量将水涂干。 5. 倒置于37度培养箱中培养24h。

6.菌落计数： 1.挑取无片状菌苔生长的平板作为计数平板，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。 2.选择平均菌落数在30～300之间的平板来计算该水样的菌落总数。如果所有的平板的菌落总数都不在30—300范围之内，则取最靠近30—300的平板进行计数 3. 如果有两个稀释浓度的总菌落数落在了30—300范围之内，则先计算两个浓度下每ml水体中细菌总数，如果两个数值的比值大于2则取小的浓度，如若小于2则取两值的平均值。