层 析 技 术 指导教师：滕利荣 教授

第一部分 层析基本理论

一、层析技术简介 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

二、层析的分类 1、按分离相状态分类 ： 根据层析过程中的固定相和流动相进行分类，大致可以分以下几类 ： （1）气相层析是以气体为流动相的层析方法，称之为气相层析。 根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质，后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。

它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。 （2）液相层析是以液体为流动相的层析方法，称之为液相层析。 同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。 （3）超临界层析是以流体为流动相的层析方式，称为超临界层析(SFC)。 它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。

2、按层析的分离机理分类 （1）排阻层析(exclusion chromatography) 利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。

（2）离子交换层析(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。

（3）吸附层析(absorption chromatography) 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。

（4）分配层析(partition chromatography) 被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。

（5）亲和层析(affinity chromatography) 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。

（6）金属螯合层析(metal chelating chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。

（7）疏水层析(hydrophobic chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。

（8）反向层析(reverse phase chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。 （9）聚焦层析(focusing chromatography) 利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。

（10）灌注层析(perfusion chromatography) 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。

三、柱层析法的一般技术 1．层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。

2．层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。

在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。

3．装柱 层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1／3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在拄内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层。最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。

4．加样 上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。

5．洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10％，溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。

6.部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。这种装置能使每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或260 nm的光吸收来进行连续监测。

第二部分 常用层析技术

一、排阻层析 （凝胶层析） 凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。

1、凝胶层析的特点及应用 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。

2、凝胶层析的原理 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；

凝胶过滤示意图

凝胶装置图 色谱峰和分离结果

3、凝胶 （1）凝胶的种类和性质 Sephadex G 系列 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 2）、琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。 3） 、聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶—P （Bio-Gel P). 4） 、 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。

（2）凝胶的选择 一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围选择合适型号的凝胶。例如蛋白脱盐常采取分离范围较小的Sephadex G-10或G-15。 选择凝胶的另一个方面就是凝胶的颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。

表 葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性 品 名 干胶颗粒 直径/μm 得水值 Wf/g.g-1 床体积 /mL.g-1 最适分段分离范围 溶胀所需 时间/h 最大流体 静力压/Pa (cmH2O) 球蛋白分 子质量／Da 线性葡聚糖 分子质量/Da 20℃ lOO ℃ Sephadex G-1O 40-120 1.0±0.1 2-3 700 3 1 >9810(100) Sephadex G-15 1.5±0.2 2.5-3.5 1500 Sephadex G-25 粗 中粗 细 超细 100-300 50-150 20-80 10-40 2.5±0.2 4-6 1000-5000 100-5000 6 2 G-50 5.0±0.3 9-11 1500-30000 500-10000 G-75 7.5±0.5 12-15 3000-70000 1000-50000 24 4905(50) Sephdex G-100 10±l.0 15-20 4000-150000 1000-100000 48 5 3434(35) G-150 15±1.5 20-30 5000-400000 1000-150000 72 1472(15) G-200 20±2.0 30-40 5000-800000 1000-200000 981(10)

（3）凝胶的处理 凝胶使用前要首先要进行处理。 1）估计用量 选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量： 干胶用量(g)＝柱床体积(ml)/凝胶的床体积(ml/g) 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10％～20％(质量分数)。

琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孑L玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。 2)水中膨化 不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短，在20℃条件下需3～4 h；但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1～5 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。 琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孑L玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。

3）排除凝胶中气泡 膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡

（4）凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂通常加入0．02％(质量分数)的叠氮化钠，4℃下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50％(体积分数)的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95％(体积分数)乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60℃烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。

4、凝胶层析的基本操作 1．层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100 cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。

2.装柱（凝胶层析柱） 1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要捧除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。

5）柱顼接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注人柱内。注意避免产生气泡。 6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。 7）柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。 8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规数值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者10％。

9）检查柱装得是否均匀和V0的测定：用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析，则既检查了装柱质量也测定了V0。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空体积(V0)。蓝色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子质量为2×106Da并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测 V0，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和6 ％以上的琼脂糖凝胶均可用0.2 ％浓度的蓝色葡聚糖2000，它在265nm及630nm处都有吸收峰。

3．洗脱液的选择 由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不像其他层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。

由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐.

4.加样量 关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～5％(质量分数)左右.

如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响分离效果。

5.洗脱速度 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散

加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2～10 ml／h，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。

总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。

二、离子交换层析 1.离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。离子交换剂是通过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的化学基团后的产物。可人为选择性地使其带有正电荷或负电荷。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的离子交换剂(称为阴离子交换剂)上；反之，称为阳离子交换剂。 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。

离子交换层析示意图

2.离子交换层析的应用 1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。 2)分离纯化小分子物质 离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为2～3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗

脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。 3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。

由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结合使用。 使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。

3.离子交换剂的处理、再生和转型 1)处理 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后即可进行处理。常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要的反离子。在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱。

2）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带上使用时所期望的离子或基团。

3）转型 长期使用过的亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可。原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提下进行。对于琼脂糖离子交换剂的处理是在使前仅用蒸馏水漂洗、缓冲液平衡后即可。其他亲水性离子交换剂的再生和转型操作和琼脂糖离子交换剂的一样。

4.离子交换层析的基本操作 （1）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：10～1：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。

（2）装柱 先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜；

（3）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。

（4）上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样母刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。

（5）洗脱缓冲液 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。 由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱

(6) 洗脱速度 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。

（7）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。

参考资料： 1.《生物学基础实验教程》，滕利荣 主编，吉林科学技术出版社，1999.8. 2.《生物化学实验指导》，余冰宾 主编，清华大学出版社，2004.1. 3.《生物化学技术原理及应用》，赵永芳 主编，科学出版社，2002.7，第三版. 4.《生物化学仪器分析与实验技术》，周先碗 胡晓倩 编，化学工业出版社，2003.1. 5.《生物化学实验技术》，何忠效 主编，化学工业出版社，2004.3. 6.《基础生物化学实验》，王秀奇 秦淑媛等编，高等教育出版社，1999.6，第二版.