=== 第八章 層析法 === 第8章 層析法 8-1 層析法基本原理 8-2 氣相層析儀 8-3 液相層析儀.

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=== 第八章 層析法 === 第8章 層析法 8-1 層析法基本原理 8-2 氣相層析儀 8-3 液相層析儀

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 應用吸附力的大小不同,作為分離混合物的層析法,稱為吸附式色層分析,其固定相通常是多孔性固體,或可稱為固體吸附劑,流動相為流體(液體或氣體)。流動相內的試樣分子並不會進入固體內,試樣分子只是在固定相的表面被固定相以吸附力吸引,當流動相流過,吸附力較小的先被帶走,滯留時間短;吸附力大的需要花較長的時間才會被流動相帶出,滯留時間長,因此可達分離之效果。

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 範例 8-1

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 範例 8-2

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 2.紫外燈顯色:若樣品本身是可產生螢光的物質,可將濾紙放置在紫外燈光下照射,化合物會吸收紫外光而呈現黑點。 3.碘薰顯色:將碘的結晶放在廣口瓶內,放入濾紙蓋上瓶蓋,會產生暗棕色的色點。這種方法是利用有機化合物與碘形成分子錯合物而帶有顏色,但烷類及鹵化烷類除外。

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 範例 8-3

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 薄層層析法(thin layer chromatography, TLC)屬於吸附層析的一種。固定相為固體,移動相為液體。固定相一般稱為TLC 片。操作薄層層析法時,以毛細管將試樣溶液點在TLC 片的一端,再將TLC片放在裝有少量溶劑,亦即展開液,的玻璃瓶(展開槽)中,移動相溶劑就會因為毛細現象,開始沿TLC片往上移動,也把試樣中的化合物帶上去,試樣中的成分對固定相的吸附力不同,因此移動的速率也就不同。如圖8-6。

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 如果試樣本身無顏色,可以採用與濾紙色層分析法相同的顯色方法,不過TLC 片的吸附劑分有含螢光成分與不含螢光成分兩種,通常不顯色的試樣會選用含螢光成分的TLC 片,所以在紫外光燈照射下即可顯現黑色色點。 在應用上,薄層層析法與濾紙色層分析法一樣,比較不適合用於定量分析。定量分析時,要先收集分離之試樣化合物,可於一開始便採用較厚的薄層,分離展開後,將含有分離成分的吸附劑刮下,再以適當的溶劑萃取純化,然後秤重定量,若有其他結構鑑別的需求,也可將分離成分拿去做進一步分析。

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理 分子篩層析法是在分離管柱填充凝膠當固定相。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固態物質,內部具有網狀篩孔,當分子流過填充凝膠的管柱時,大分子無法進入凝膠篩孔,而只流經凝膠及管柱間的孔隙,於是很快就可以流出管柱;較小的分子因為進入凝膠內的篩孔,故在管柱內的停留時間較長,因此便能將大小不同的分子分離。這種層析法常應用於推測高分子化合物的分子量,分子量越大,分子就越大,滯留時間就越短,與已知分子量的物質比較滯留時間,而推測未知試樣的分子量。一般狀況下,凝膠不會吸附成分,所有欲分離物質都會被洗出,這是凝膠層析法與其他層析法不同的地方。

8-1 層析法基本原理

8-1 層析法基本原理

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 第二種:氣相-液相層析法。利用分析物在氣態移動相,以及附著於惰性固體表面上之液體固定相之間的分配作用,而予以分離。 在氣相層析法(GC)中,樣品被氣化後注射至層析管柱之前端。移動相的沖提是由於惰性氣體之流動,與其他類型之層析法最大不同之處是,移動相並不與分析物作用,因而通常需要較長的分析管柱,移動相氣體的功能僅是載動分析物流經分析管柱,稱為載流氣體。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 1 載流氣體 載流氣體必須具有化學惰性,常用者包括氮氣、氦氣、氫氣和二氧化碳等,使用何種氣體,通常視偵檢器而定,其中氦氣使用最廣。為延長儀器、管柱壽命與增加分析靈敏度,載流氣體進入儀器前,須先去除氣體中之雜質,如水分、氧氣與碳氫化合物等。

8-2 氣相層析儀 2 注入口 注入口的最前端是一片矽膠墊片,試樣注入時通常以微量注射針穿透過矽膠墊片,進入管柱前端立即揮發,而被載流氣體攜帶,這個矽膠墊片是具有彈性的,可以容許多次的穿透而不致於漏氣,但經不斷的使用之後,仍需經常注意更換,否則使用一段 時間後會磨損而漏氣。由於試樣必須要氣化才能被攜帶,因此注入口的溫度通常設定在250 ℃以上。 試樣為固體時,需溶於揮發性溶劑中,再取少量注入即可,試樣為液時也採相同操作。有時,液體也可考慮直接注入,但如此容易造成注入過多試樣,管柱無法負荷而導致分離效果不佳。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 氣相層析儀中的GLC,其固定相為液態,為管柱內固體填充物上的液體薄膜,固體填充物亦稱為載體(support),可分為非極性、中等極性及極性三種。 非極性的載體,例如活性碳,與試樣的吸附力主要為凡得瓦力,分子量越大作用力越大,在管柱上的滯留時間也越長,而分子量與沸點成正比,因此試樣通過管柱的先後順序與試樣的沸點成反比,沸點越低者越快通過,因此這一類管柱常被稱為沸點管柱。

8-2 氣相層析儀 管柱內的材料若為中等極性(如氧化鋁)與極性(如沸石),其和試樣的作用力就不只凡得瓦力,因此試樣通過的先後順序較難預測,通常極性高的試樣與極性固定相吸附力較大,在管柱上的滯留時間會較長。使用高極性管柱時要注意,有可能發生某些化合物吸附其上而無法被帶出。 載體本身雖很穩定,但是有些液相材料並不穩定,溫度過高時會被破壞而被載流氣體帶出,管柱就失去功能,因此使用之前必需確認管柱內的填充物可承受之極限溫度(maximum temperature), 任何時候管柱的溫度都不得高於此溫度。

8-2 氣相層析儀 4 加溫爐 氣相層析儀的試樣是以氣態進行分析,整個層析過程需維持在高溫狀態,操作時需依照試樣的性質設定溫度範圍,因此從注入孔到管柱都須置於加溫爐中,以確定在整個層析過程中試樣是氣態,且能得到合理的滯留時間。加溫爐的溫度是可調整的,溫度越高,氣體動能越大,試樣行進的速度也越快。提高管柱溫度有助於縮短滯留時間,但若溫度不適當,分離效果會降低。一般設定管柱溫度等於或略高於樣品的平均沸點,即可得到合理之滯留時間。而對於沸點差異大的試樣混合物進行層析時,可以使用溫度控制器的連續性或階段性升溫方式予以分離。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 2.熱導電度偵檢器(TCD):利用不同物質之熱傳導度不同的原理,當試樣流經惠斯頓電橋時,因熱傳導度不同而產生電阻值之變化,測定其變化而得分析圖譜。惠斯頓電橋的裝置如圖8-14,在右側的電阻絲(R2)讓不含試樣的載流氣體通過,做為對照側;在左側的電阻絲(R1)則讓攜帶試樣的載流氣體通過。在固定的電壓以及固定的氣體流速下,通過兩側電阻絲的氣體若都不含試樣時,位於惠斯頓電橋中央的架橋電阻絲之中間位置可找到一零電位點。但當左側通過兩股串聯電阻絲之氣體中含有試樣時,因為氣體的導熱係數改變了,致使兩側電阻絲溫度不同,電阻產生變化,因此就改變了架橋電阻絲兩端的電位A-B,零電位點的位置產生偏動,於是訊號產生。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 以TCD當偵檢器時,偵檢器的溫度設定須比注入口與分析管柱高。除此之外,載流氣體的導熱能力也很重要。氫氣及氦氣的導熱係數大,為最理想的選擇。因大部分的有機物試樣導熱係數都不高,氫氣或氦氣與其混合時,造成的導熱係數落差會很大,故可得高靈敏度。但氫氣具危險性,氦氣則較貴,各有缺點。氮氣雖導熱係數低,卻便宜又安全,有時也會被使用。但因其導熱係數與有機物試樣相近,與有機物試樣混合後,造成的導熱係數之變化有正亦有負,所以會產生正向或負向的訊號。

8-2 氣相層析儀 TCD 為非破壞性的偵檢器。一般而言,偵測靈敏度TCD 也不會比FID 差,且價格便宜又安全,因此用途很廣。但為保護惠斯頓電橋的電阻,TCD 一般不適合用於鹵化物的試樣;若分析管柱使用毛細管柱,因為注入試樣很少,大都還是以FID 為偵測器。

8-2 氣相層析儀 3.電子捕獲偵檢器(ECD):應用於以氬或氦氣為載流氣體的氣相層析。偵檢器以放射性物質放出射線(電子流),利用試樣中不同成分對電子流之影響不同,測定其電子流變化情形則得到分析圖譜。一般含鹵素之碳氫化合物常使用此種偵檢器。 4.光游離偵檢器(PID):以紫外光使樣品分子游離帶電,再測量其游離帶電之情形以得到電子訊號,依訊號強弱得到分析圖譜。一些在火燄離子偵檢器FID 靈敏度較低之物質,以PID 測定時有很好的靈敏度,故此偵檢器逐漸普遍應用。

8-2 氣相層析儀 5.火燄激發偵檢器(FPD):類似火燄傳導偵檢器,以氫氣火燄將樣本中所含之磷或硫轉變為特殊型態,偵測該光譜之波長特性及強度,可得定性及定量之結果,因此一般適用於含磷或硫的試樣。 選擇偵檢器時,通常選擇對分析試樣有好的靈敏度、穩定性與再現性、對分析試樣偵測時濃度線性範圍大、有高預測性與選擇性、且對試樣沒有破壞性。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 氣相層析儀常應用於沸點低之液態或氣態有機物之定量及定性分析,如農藥的檢測或是醇類、酯類、酮類、醛類、醚類與芳香烴類等有機試樣,多以氣相層析儀分析。在環境汙染檢驗上,氣相層析儀是應用最廣的分析儀器。 操作時先依分析試樣的性質選擇適當之分析條件,例如:注入口溫度、偵檢器溫度、管柱種類、管柱溫度、載流氣體流率等。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 解析度太小,兩個峰無法徹底分離;解析度太大,分離時間需長,工作效率低。因此一般要求R>1.5,或是按照研究或分析的需求作調整。 影響解析度R 值的因素主要有三個,理論平板數、滯留因子及分離選擇性因子。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 範例 8-4

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 1.渦流擴散 渦流擴散又稱多徑擴散:因為流動相分子在管柱內,所通過的路徑不同,如圖8-23,所以走的路徑長短亦不同,導致同一物質在管柱內停留的時間不同,使尖峰變寬。渦流擴散可藉由管柱填充物粒徑減小而改善,因為粒徑減小,填充物粒徑間的移動相路徑之長短差異就較小。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 3.非平衡之質量轉移 非平衡之質量轉移又稱傳質阻力。有時因為移動相的流速太快,使得試樣分子在移動相與固定相之間的平衡來不及達到,相之間的平衡無法真正實現,所造成的尖峰寬度就變寬。非平衡之質量轉移是影響液相層析管柱效率高低的最重要因素。可藉由流速的調整與填充物粒徑減小與管柱變細,盡量使相之間能達到平衡。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 範例 8-5

8-2 氣相層析儀 氣相層析儀是在分離混合物時非常有用的工具,但是,在定性分析的部分,雖說可利用滯留時間做定性分析,鑑定推測未知試樣的成分,但只由繪出的圖譜上看到訊號,並不能夠知道其結構,因此在結構的判定上仍有賴於其他光譜分析的工具來確認。所以,一般須先知道未知試樣可能為哪幾種,例如做農藥的殘留分析時,已知可能是哪幾種農藥試樣存在,設定好分析條件時,先注入這些推測可能的農藥化合物測出滯留時間,才能與未知試樣比對。若未知試樣的範圍太大,即使滯留時間相同,亦不能確認其成分化合物,需藉由其他儀器做進一步確認。

8-2 氣相層析儀 定量分析是利用各成分之濃度與圖譜上之尖峰面積成正比的原理。 尖峰面積的求法有切割稱量法、三角測量法和積分器法3 種。 1.切割稱量法 將尖峰之圖形剪下來,然後與已知面積、材質相同的紙張質量相比,即可推算出尖峰面積。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 3.積分器法 利用精密的電子式積分儀器,即可順利求出尖鋒下面積。現在的層析儀都配備有電腦,可以做這樣的運算,因此直接就會顯示出每一個尖峰的面積。 定量分析時,實驗要預先確定待測物,再配製濃度範圍涵蓋試樣濃度之標準液,接著由儀器所得的分析圖譜積分計算波峰面積(或波峰高度),然後由波峰面積(或波峰高度)與濃度繪製之檢量線,便可由檢量線換算求出各成分之濃度,如圖8-27。

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 範例 8-6

8-2 氣相層析儀

8-2 氣相層析儀 氣相層析儀的實際用途非常廣泛,不管是材料的分析,食品,藥物的品管,毒品、違禁藥品的偵測方面,氣相層析儀都具有重要的實務功能,甚至為了能現場檢測,還開發出現場型氣相層析儀,例如目前常用於石油碳氫化合物分析的現場氣相層析儀,包括可攜式氣相層析儀(portable GC)與可運送氣相層析儀(transportable GC)兩種。可攜式氣相層析儀具有內藏式電池與載流氣體供應系統,耐用、體積小及重量輕,但因受限於電源與氣體的供應,其管柱通常是恆溫(isothermal)。可運送氣相層析儀,操作時需要外部電源與氣體供應系統,故不具有可攜性,通常是安裝於移動式實驗室,大部分的可運送氣相層析儀可以快速改變管柱溫度,故可做適當的溫度設定,精密度因此較高,其用於現場時可以提供等同於實驗室氣相層析儀的分析數據。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 液相層析是一種分離的技術,其分離原理會根據管柱的不同而不同,一般分為分配層析、吸附層析、離子交換層析及分子篩層析法,如表8-2,這部分已於8-1 節介紹過。其中主要為分配層析法,此法是利用含混合物之移動相流經固定相,混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同(即親和力不同),因此各成分移動速率不同,而達到分離的目的。試樣化合物與固定相親和力若較強,則沖提較慢(滯留時間長),試樣化合物與移動相的親和力較強,則沖提較快(滯留時間短)。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀是將固定相之管柱變細、固體顆粒減小,以提高分離效率與減少移動相(沖提液)的使用量,但因為液體通過細微膠體時阻力增大,故需藉由高壓幫浦輸送液體以利移動相流動。目前,高效能液相層析儀為分析實驗必備之研究工具。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀的移動相是液體,儲放於儲液設備。液體中容易溶解空氣,尤其是甲醇與水混合時容易產生氣泡,氣泡中的氮氣或氧氣會對偵檢器造成干擾,因此移動相在使用前,須先除氣,可藉由超音波震盪、加熱、攪拌、濾膜過濾、通氦氣等方式進行,其中通氦氣進入溶劑中,可以趕走其他氣體,且氦氣密度小,會自行排走。最簡單的方式就是用一個非常小孔隙的過濾器在真空下過濾,可以除氣和順便除去懸浮物質。

8-3 液相層析儀 移動相並不一定為單一純溶劑,可以為混合的溶劑,溶劑分配閥可根據操作者的設定,調整溶劑的混合比例。在移動相的沖提過程中,使用固定比例的溶劑,稱為等位沖提(isocratic elution);過程中根據時間,設定不同溶劑混合比例者,稱為梯度沖提(gradientelution)。液相層析有時可使用梯度沖提法,以縮短分析時間並增加分離效果,與氣相層析儀的階段升溫類似。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 為解決流量脈衝的問題,常使用並聯幫浦或串聯幫浦兩種設計。如圖8-32 為並聯幫浦的設計。當A 幫浦壓縮移動相進入管柱時,B幫浦為退出並吸入移動相,由於A、B兩個幫浦的一進一出方向不同,可以修正流量脈衝,使移動相的液壓維持恆定,以修正流量脈衝的問題;但由於單向閥的數量增多,所以容易造成洩漏,增加了使用和維護的難度。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 如圖8-33,為串聯往復式幫浦,A、B兩幫浦的活塞運動速度不一定要相同,一般來說,A 幫浦的活塞運動速度為B 幫浦活塞運動速度的2 倍。因此,相同時間內,A 幫浦提供的流量為B 幫浦的兩倍,B 幫浦提供的移動相溶劑一半直接供給系統,另一半被A 幫浦吸入,稍後供給液相系統,因此可解決流量脈衝的問題。雖然增加脈衝緩衝器,但是減少單向閥使用量,因此可降低儀器所需的維護。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 二極體陣列偵檢器,如圖8-42,亦屬於紫外光/可見光吸收原理之偵檢器,其與可變波長偵檢器的差異在於試樣位於光柵之前,因此光柵不需旋轉。二極體陣列偵檢器可得到紫外吸收光圖譜、可做三維圖譜、可最佳化層析檢測條件、可提取所需波長下的層析圖並可進行尖峰純度檢驗等。二極體陣列偵檢器的功能較強,同樣的,操作之參數設置就比較複雜,需要合理設置,以獲得最佳檢測靈敏度。實際運用時,需參考儀器所提供的操作手冊做設定。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 圖8-43 為利用二極體陣列偵檢器採集到的紫外吸收光譜進行純度檢驗,純度因數(purity match)為分離之成分試樣與該化合物標準品之光譜圖比較,重疊度越大,純度因數就越高,代表越可能是純物質所流出之吸收峰,純度因數最大值為1000。

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀

8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀可藉由選擇適當管柱(固定相)與適當溶劑的比例(移動相),將混合物試樣分離並純化,因此其應用範圍相當廣泛,包括在化學、化工、生化、農化、醫藥檢驗、環境檢驗、食品飲料等各類試樣分析。尤其對熱不安定、非揮發性物質、高極性成分,不便使用氣相層析儀(GC)者皆可使用HPLC。

8-3 液相層析儀 選擇沖提劑時,除了考慮極性高低,是否能分離出試樣之外,尚有以下幾點須注意的: 1.沖提液不能改變分離管柱的特性。 2.沖提液適合偵檢器。 3.沖提液要能溶解試樣。 4.沖提液黏度低。 5.沖提液能使分離之試樣成分回收容易。 6.沖提液純度高,通常需使用光譜級溶劑。

8-3 液相層析儀