第十五章 甾体激素类药物 的分析 Analysis of Steroid Hormones

发现与发展 1、甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质。 2、1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(Estrone，1932年)、雌二醇(Estradiol,1932年)、睾酮(Testosterone，1935年)及皮质酮(Corticosterone,1939年)等的纯品结晶，之后又阐明了其化学结构，从此开创了甾体化学和甾体药物化学的新领域。随后，又有许多重大的成就。 3、发明用薯蓣皂甙(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使生产规模扩大，成本降低。 4、发现肾上腺皮质激素治疗风湿性关节炎及其在免疫调节上的重要价值，使甾体药物成为医院中不可缺少的药物。 5、甾体口服避孕药的研究成功，使人类生育控制达到了新水平。

第一节 基本结构与分类： 18 12 17 11 13 19 C D 16 1 9 14 2 15 8 A 10 B 3 4 7 5 6 基本结构：环戊烷并多氢菲

分类： 肾上腺皮质激素 雄性激素及蛋白同化激素 甾体激素 性激素 孕激素 雌激素

一 肾上腺皮质激素

(2)束状带 糖皮质激素，可的松，氢化可的松 调节糖、蛋白质、脂肪代谢 (3)网状带 分泌性激素，雄激素和雌激素 肾上腺皮质的组织结构分为三层：自外向内分为 (1)球状带 盐皮质激素，主要为醛固酮, 调节水盐代谢 (2)束状带 糖皮质激素，可的松，氢化可的松 调节糖、蛋白质、脂肪代谢 (3)网状带 分泌性激素，雄激素和雌激素

糖皮质激素的药理作用 1. 抗炎作用 2. 抗免疫作用 3. 抗毒作用 4. 抗休克作用 5. 对血液系统的影响 6. 对代谢的影响 7. 其它作用

肾上腺皮质激素 氢化可的松（天然）

肾上腺皮质激素 醋酸地塞米松 （合成）

肾上腺皮质激素主要结构特征 （1）A环4-3-酮结构，有紫外吸收 （2）D环的C17上-醇酮基，有还原性。 （3）10位、13位-甲基， 11位羟基、羰基等受立体效应影响， 无利用价值； 人工合成品：1、2位间有双键，6，9位引入卤素，16或16位引入甲基，16位引入羟基。

二 雄性激素 睾酮（天然） △４-3-酮 基

丙酸睾酮（合成）

蛋白同化激素 苯丙酸诺龙（合成）

雄性激素及蛋白同化激素 结构特点： 雄性激素母核含有19个C， 蛋白同化激素的C10位无角甲基，母核含有18个C， A环的4-3-酮，有紫外吸收； C17位b羟基或由它们形成的酯

三 孕激素 黄体酮（天然）

人工合成孕激素分类： 孕酮类：醋酸甲地孕酮 睾酮类：炔诺酮、左炔诺孕酮

孕酮类 口服 孕激素活性增强 醋酸甲地孕酮

睾酮类 ？ 在睾酮的17α位引入乙炔基，得到炔孕酮。 炔孕酮 大大降低了雄激素活性，具有抑制排卵作用，口服孕激素活性比黄体酮强15倍。

去掉炔孕酮C19甲基，得到活性更强炔诺酮，是人类历史上第一个口服避孕药。 炔诺酮的18位引入一个甲基，得到左旋体口服药左炔诺孕酮 是第一个实现工业化生产的全合成甾类激素。 18 左炔诺孕酮

孕激素结构特点 A环的4-3-酮，有紫外吸收； C17位有甲酮基 或乙炔基 多数在C17位上有羟基或被酯化。

抗孕激素 孕激素拮抗剂指与孕激素竞争受体并拮抗其活性的化合物，也称抗孕激素。 在20世纪80年代抗孕激素尚未成为药物。 1982年法国Roussel-Uclaf公司推出米非司酮作为抗早孕药 促进了抗孕激素及抗皮质激素药物的发展。 是甾体药物研究历史上的一个里程碑。

与炔诺酮相比，在三个位置上进行了结构修饰 米非司酮

抗孕激素典型药 临床应用 米非司酮在靶细胞上竞争性抑制孕激素。 - 黄体期和妊娠期的激素 妊娠早期使用可诱发流产。 抗早孕时与前列腺素类药合用。 -如口服200mg后再口服1mg 对早孕妇女可获得90～95%的完全流产率 前列腺素类

四 雌激素 卵泡激素 （雌二醇）天然 （estradiol） 3 苯环

（炔雌醇） （ethinylestradiol） 雌激素 （炔雌醇） （ethinylestradiol） 乙炔基

雌激素的结构特征 A环为苯环，3位上有酚羟基或成酯 D环17位：b羟基或成酯、有些药物有-乙炔基

小结 甾体激素 碳原子数 A环 17位取代基 肾上腺皮质激素 21 4-3-酮 -醇酮基 雄性激素 19 -OH -CH3 孕激素 甲酮基 雌激素 18 苯环C3-酚OH -C≡CH

第二节 理化性质与鉴别试验 一. 性状特征 1.性状及溶解度：白色至微黄色粉末或结晶性粉末，脂溶。 2.熔点：性状或鉴别。 3.比旋度：具有旋光性 4.吸收系数：鉴别或含量测定

二 化学鉴别法 （一）与强酸的显色反应（各国药典） （母核） H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl 甾体激素类药物 呈色或荧光

与硫酸显色反应 显 色 荧光 加水稀释 泼尼松龙 深红 絮状↓灰 泼尼松 橙 黄→蓝绿 炔雌醚 橙红 黄绿 ↓红色 炔雌醇 橙红 黄绿 絮状↓玫红 醋酸可的松 黄或微 褪色并澄 带橙 清

(二) 官能团的反应 1 C17 – α – 醇酮基 还原性 A. 呈色反应 肾上腺皮质激素药物 四氮唑盐 OHˉ 呈色

B. 沉淀反应 氨制硝酸银 肾上腺皮质激素药物 Ag↓黑色 碱性 酒石酸铜 Cu2O↓红色

2. C3–酮基和C20–酮基 羰基试剂 甾酮类激素药物 呈色 ＃常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼

异烟腙（黄色） 睾酮

黄体酮 异烟双腙（黄色）

3. C17-甲酮基 具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物 亚硝基铁氰化钠 间二硝基酚 芳香醛 呈色

黄体酮 蓝紫色 亚硝基铁 氰化钠 其他甾体 淡橙色or 不显色

黄体酮 蓝紫色

4. 酚羟基（JP） 雌激素类药物 重氮苯磺酸 红色偶 氮染料

5. 乙炔基 硝酸银 含炔基的甾体激素 白色银盐沉淀 ↓

炔雌醇 白

6. 有机卤素 呈色 茜素氟蓝 硝酸亚铈 有机氟 Fˉ 有机破坏 有机氯 Clˉ 硝酸—硝酸银 AgCl↓

茜素氟蓝 F- 蓝紫色

7 酯的反应 醋酸 香

特臭 特臭

官 能 团 显 色反 应 反 应 基 团 加 入 试 剂 现 象 备 注 四氮唑盐 TTC BT C17-a-醇酮基 双formazan 反 应 基 团 加 入 试 剂 现 象 备 注 三苯formazan 四氮唑盐 TTC BT C17-a-醇酮基 双formazan 可定量分析 C = O 羰基试剂(异烟肼,硫酸苯肼) 腙 可定量分析 C17:甲基酮 （黄体酮） 亚硝基铁氰化钠 络合物 专 属 反 应 酚羟基 重氮苯磺酸 偶氮染料 比色分析 F 茜素氟蓝 蓝

官 能 团 沉 淀 反 应 反应基团 加入试剂 现 象 C17--醇酮基 C17-  -醇酮基 R—C≡CH R—Cl 斐林试剂 现 象 C17--醇酮基 C17-  -醇酮基 R—C≡CH R—Cl 斐林试剂 AgNO3 Cu2O Ag R-C≡CAg AgCl

三 UV法 例：丙酸倍氯米松 EtOH 20μg/ml, λmax239nm,A: 0.57-0.60, 1、4-3-酮基(强吸收)240nm ；2、雌激素：A环（苯环）278nm, 中强吸收 例：丙酸倍氯米松 EtOH 20μg/ml, λmax239nm,A: 0.57-0.60, A239/A263=2.25-2.45

ν 四 IR法 （原料药） 3750～3300cm-1 3300～3000cm-1 3000～2700cm-1 1900～1650cm-1

炔雌醇 结构特征：酚羟基、C17 –OH C17 –乙炔基

ν ν ν 3300cm-1 1615cm-1 1590cm-1 3610cm- 3505cm- 1505cm-1 苯环的骨架振动 酚羟基 醇羟基

五 色谱法 1. TLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。

2. HPLC法 方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。

第三节、 特殊杂质检查 一 有关物质的检查 来源:原料、中间体、异构体、降解产物 特点: （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似

1.TLC法（自身稀释对照法） 判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色(与低浓度溶液的主成分斑点比较） 特点： （1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。

点样, 展开, 四氮唑显色, C1如显杂质斑点,不得>3,且颜色不得比C2的主斑点深. 例:氢化可的松中 有关物质: 样: 3mg/ml(C1), 60μg/ml(C2), 点样, 展开, 四氮唑显色, C1如显杂质斑点,不得>3,且颜色不得比C2的主斑点深. L=2% 供试液 对照液

2. HPLC法（主成分自身对照法） 判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积

醋酸甲地孕酮 取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）和溶液（2）各10μl，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。

二 硒的检查 剧毒 来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢 原理

醋酸氟氢松检查硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0 后，转移至分液漏斗中，用水少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（1→2）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2′，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供＜A对。 L=0.01%

三 残留溶剂的检查 GC法:顶空进样 甲醇 ≤0.3% 丙酮 ≤0.5% 内标法 + 校正因子

四 游离磷酸盐 磷钼酸比色法 地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠

地塞米松磷酸钠 检查游离磷酸 精密称取本品20mg，置25ml量瓶 中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫 置30～50分钟，照分光光度法，在740 nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法 处理的吸收度比较，不得更大。

（对照液 0.0035%KH2PO4）

第四节、含量测定 一.HPLC法 RP－HPLC（大多内标法） 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶(C18或ODS柱) , 流动相：CH3OH-H2O , 检测器：UVD（ 240nm,254nm或280nm ） 特点 用样量少，灵敏度高，分离效 果好，测定速度快

二 UV法 △４-3-酮 240nm（±） 肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素 苯环 280nm（±） 雌激素

三 比色法 1. 适用于非分光光度活性药物 2. 使待测组分光谱位移，避免干扰 3. 增加测定灵敏度 4. 增加选择性 三 比色法 1. 适用于非分光光度活性药物 2. 使待测组分光谱位移，避免干扰 3. 增加测定灵敏度 4. 增加选择性 提问可采用什么方法来提高甾体激素类药物的分光光度活性。

(一)四氮唑比色法 1. 原理 肾上腺皮质激素类 C17 -α－醇酮基 强还原性 OH - [还原]

[O] 分子重排 OH-

氯化三苯四氮唑 （TTC） 红四氮唑（RT） 三苯甲瓒↓深红

蓝四氮唑（BT）

双甲瓒（暗蓝）

2. 方法 对照品法 40～45′ 暗 ChP TTC（RT） BP TTC（RT） USP BT

3.讨论： (1)基团的影响：C11-C=O>C11-OH， C21-OR，R小可反应， R大难反应 (2)溶剂和水的影响 要求：无水乙醇——（无醛乙醇） 含水量≯5%，对结果无影响 含水量为10%，吸收度约降低10% 含水量为30%，反应完全受到抑制 (3)碱液种类与加入顺序 先加TTC,后加氢氧化四甲基铵， (4)空气:光线——避光, 氧气——通N2 （5）T与t：室温，40-45min

4. 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品 的稳定性（氧化及降 解产物无此反应）

（二）异烟肼比色法 C3－酮基 肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素 1. 原理 HCl （缩合）

异烟腙（黄色）

2. 方法 对照品法

C3=O＞C17=O 、C20=O C11=O不反应 讨论： 1、兼顾两种试剂的溶解度：无水乙醇 2、酸的种类和浓度： HCl，HAc，H2SO4 酸：异烟肼=2：1；[H+]=0.0074mol/L，异烟肼浓度：0.0365mol/L (0.5mg/ml) 3、水分, T, O2, 光线：无水（H2O↑→A↓） 4、反应的专属性： 对4-3-酮基专属性好

（三）Kober反应比色法 雌激素 1. 原理

雌二醇-3-甲醚 λmax=467 λmax=515

Kober反应缺点： （1）条件较难控制，易出双色→黄+红 （2）重现性较差： ① 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。 ① 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。 ② 甾体激素提取物中其他物质及制剂中稳定剂、赋形剂、溶剂对测定有干扰。

铁-酚试剂法 ①   铁酚试剂的组成 硫酸亚铁铵、浓硫酸 、过氧化氢、 苯酚 ②   浓硫酸和过氧化氢的作用 浓硫酸和过氧化氢将2价铁氧化成3价铁。

③三价铁的作用 ⅰ．能够加快黄色生成的速度 ⅱ．能促进黄色向红色的转变 ⅲ．能增加红色的稳定性 ④   苯酚的作用 ⅰ．可消除反应产生的荧光 ⅱ．能够促进红色的生成

中国药典 Kober 反应吸收光谱 第一步反应 第二步反应 515 465 450 500 550nm A Kober 反应吸收光谱 第一步反应 采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量

比色法与紫外分光光度法的比较 比色法 紫外法 药物需经处理显色 不需要 可见光 可见－紫外区 比色计、分光光度计 紫外分光光度计 比色法 紫外法 药物需经处理显色 不需要 可见光 可见－紫外区 比色计、分光光度计 紫外分光光度计 单色光纯度不够，A不恒定 单色光足够，A恒定 对照品比较法（显色影响因素多） 吸收系数法，对照品比较法

第五节.体内样品中甾体激素分析 生物体中内源甾体激素及其代谢产物干扰测定，且浓度低，所以首选GC，HPLC，GC-MS和HPLC-MS 血清1ml→CH3COOEt 5ml, 离心, 取上层液4ml, 50°C/N2吹干，加0.1mlMobile 离心, 取上清液20µl进样分析. 外标法按H计算血药浓度.

小结 每类代表药物，结构特点，重要官能团 鉴别：官能团的显色反应，沉淀反应 杂质检查：有关物质, Se 含量测定：每一种方法原理、条件，适用药物. 重点:HPLC, 比色法(专属).