The Analysis of Steroid Hormon Drugs 第十章 The Analysis of Steroid Hormon Drugs 甾体激素类药物的分析 药学院 药物分析教研室

学习内容 Learning Contents 第一节:结构与分类（Structure and classification） 第二节:鉴别试验（Identification test） 第三节:特殊杂质检查（Detection of specific impurities ） 第四节:含量测定 (Assay)

思考题 Thinking Question 甾体激素类药物的结构特征？

基本结构 1.Δ4-3-酮，C20酮基 2.C11： 或 3.C17： ， 母核:环戊烷骈多氢菲 第一节 结构与分类 Structure and classification 基本结构 1.Δ4-3-酮，C20酮基 2.C11： 或 18 12 13 17 11 19 C C D D 16 3.C17： ， 1 9 10 14 2 8 15 A B A B 3 7 5 4 6 母核:环戊烷骈多氢菲

分 类 肾上腺皮质激素 雌激素 甾体激素 雄性激素 性激素 蛋白同化激素 孕激素 第一节 结构与分类 Structure and classification 分 类 肾上腺皮质激素 雌激素 甾体激素 结构修饰 雄性激素 性激素 蛋白同化激素 孕激素

一、肾上腺皮质激素 第一节 结构与分类 Structure and classification 天然皮质激素： 母核有21个碳原子 （还原性） C11–β-羟基 天然皮质激素： 氢化可的松 (hydrocortisone) 母核有21个碳原子 △4–3–酮基 （紫外吸收）

结构修饰 抗炎作用增强 用时间 21-酯化 1,2-双键 延长作 16α-甲基 9α-氟 醋酸地塞米松 (dexamethasone acetate)

地塞米松磷酸钠 曲安奈德 氢化可的松 (hydrocortisone) —CH3 醋酸地塞米松 (dexamethasone acetate) 氢化可的松 (hydrocortisone) 曲安奈德

二、雄性激素和蛋白同化激素 天然雄性激素：睾酮 母核有19个碳原子 第一节 结构与分类 Structure and classification 二、雄性激素和蛋白同化激素 17-β-羟基 天然雄性激素：睾酮 母核有19个碳原子 绝经期综合症； 乳腺癌 △4–3–酮基

(testosterone propionate) 甲睾酮(methyltestosterone) 丙酸睾酮 (testosterone propionate) 睾酮 C17-OH酯化增加脂溶性，制成油注射剂，延长作用时间 甲睾酮(methyltestosterone) C17加烃基增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强可口服

蛋白同化激素 第一节 结构与分类 Structure and classification 母核有18个碳原子 10位去甲基 将A环结构改造 增加蛋白质的合成，促进肌肉发育。骨折不易愈合和老年骨质疏松。 均可明显降低雄性激素作用 增加蛋白同化作用 4位引入卤素

(nandrolonephenylpropionate) 代表药物 19位去甲基 4位引入卤素 苯丙酸诺龙 (nandrolonephenylpropionate) 4-氯醋酸睾丸素

三、孕激素 第一节 结构与分类 Structure and classification 天然孕激素： C17-甲酮基 黄体酮（progesterone） 母核有21个碳原子 口服被迅速破坏失效，只能肌注 △4–3–酮基 先兆性和习惯性流产，功能性子宫出血

黄体酮 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate ) 米非司酮 (mifepristone ) 口 服 增 效

四、雌激素 第一节 结构与分类 Structure and classification 天然的雌性激素： 母核有18个碳原子 雌二醇(estradiol) 母核有18个碳原子 结构不稳定，口服无效 A环为苯环 C3-酚羟基 治疗更年期综合征、骨质疏松，口服避孕

雌二醇 炔雌醇

结 构 修 饰 口服 高效 长效 乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，可口服 炔雌醇 17位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效 戊酸雌二醇 3位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效 苯甲酸雌二醇

口服避孕药 第一节 结构与分类 Structure and classification 炔诺酮(norethisterone) 炔诺孕酮（norgestrel） 口服、长效，17-OH作成庚酸酯， 注射一次可维持3个月。

小结: 甾体激素类药物的结构特征 第一节 结构与分类 Structure and classification 甾体激素类型 母核C数 肾上腺皮质激素 21 △4–3–酮 C17–α–醇酮基 雄性与蛋白同化激素 19(18) C17–β–羟基 孕激素 C17–甲酮基 雌性激素 18 苯环、C3-酚羟基

第二节 鉴别试验 Identification test 物理常数的测定 化学鉴别法 制备衍生物测定熔点 UV-ViS分光光度法 IR法 TLC法 HPLC法

第二节 鉴别试验 Identification test 一、物理常数的测定 1.熔点 黄体酮：128 ℃ ～131℃ 2、比旋度 偏振光透过长为1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定的波长和温度下测得的旋光度。 [α]20D=100α/lc 丙酸睾酮：10mg/ml乙醇+84°～ +90 ° 3、吸光系数 氢化可的松→无水乙醇10μg/ml→λmax 242nm, E1%1cm 422~448.

第二节 鉴别试验 Identification test

第二节 鉴别试验 Identification test 二、化学鉴别法 （一）与强酸的呈色反应 强 酸 H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl 硫酸-甲醇或硫酸-乙醇 酮基先质子化，形成正碳离子， 再与HSO4-作用呈色。 原 理

第二节 鉴别试验 Identification test 与硫酸的显色反应 显 色 荧光 加水稀释 氢化可的松 棕黄色至红色 绿色 黄色至橙黄色 炔雌醇 橙红 黄绿 玫红絮状↓ 炔雌醚 红色↓ 泼尼松 黄→橙 — 黄色渐变蓝绿色 泼尼松龙 深红 灰色絮状↓ 地塞米松 淡红棕色 颜色消失 苯甲酸雌二醇 黄绿色 蓝色 淡橙色

第二节 鉴别试验 Identification test (二)官能团的反应 １、C17–α–醇酮基的呈色反应（还原性） 适用：肾上腺皮质激素 反应试剂： 碱性酒石酸铜试液（斐林试液） 氨制AgNO3试液（多伦试液） 四氮唑试液 沉淀反应 显色反应最为常用，不但可用作薄层色谱法的显色剂，还可用于含量测定

第二节 鉴别试验 Identification test 碱性酒石酸铜试液 ＋ 2Cu2+ + 4OH- + Cu2O + H2O 橙红色 氢化可的松 水合醛 氨制AgNO3试液 ＋ 2Ag+ + 2OH- +2Ag + CH3COOH 黑色 醋酸去氧皮质酮 水合醛

第二节 鉴别试验 Identification test 四氮唑试液 + H2O + OH- 醋酸泼尼松 氯化三苯四氮唑（TTC） + + CH3COOH 水合醛 深红色的三苯甲鐕

第二节 鉴别试验 Identification test 结论： 反应在碱性条件下（水解）进行。 三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色法测含量。 四氮唑反应还用于肾上腺皮质激素类药物中杂质“有关物质”检查的显色剂。

第二节 鉴别试验 Identification test ２、C3–酮基和C20–酮基的的呈色反应 与羰基试剂反应生成腙 2,4-二硝基苯肼 异烟肼 硫酸苯肼

第二节 鉴别试验 Identification test 异烟腙（黄色） 睾酮 异烟双腙（黄色） 黄体酮

第二节 鉴别试验 Identification test 结论： 成腙反应中 C3–酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。 C20–酮基受C18甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。 C11–酮基受C10、C13位甲基的阻碍，不发生反应。

第二节 鉴别试验 Identification test 3.甲酮基的呈色反应 孕激素 适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物。 能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。 蓝紫色 黄体酮 黄体酮专属性反应。与其他甾体反应呈淡橙色或不显色。

第二节 鉴别试验 Identification test 活泼亚甲基 定 义 羰基邻位的亚甲基叫活泼亚甲基。 氢化可的松 雌酮

第二节 鉴别试验 Identification test 4.酚羟基的呈色反应 适用：雌激素类药物。 能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。 H+ + 苯甲酸雌二醇 （日本药局方） 红色

第二节 鉴别试验 Identification test 5、炔基的沉淀反应 适用：含炔基的甾体激素类药物 （炔雌醇、炔诺酮、炔诺孕酮）。 机理： + + HNO3 ↓ 炔雌醇 白色

6.卤素的反应 Fˉ Clˉ AgCl↓ 茜素氟蓝 硝酸亚铈 有机氟 有机破坏 有机氯 硝酸—硝酸银 蓝紫色 回流 4-氯醋酸睾丸素 醋酸地塞米松 茜素氟蓝 硝酸亚铈 Fˉ 有机氟 有机破坏 有机氯 回流 Clˉ 4-氯醋酸睾丸素 硝酸—硝酸银 AgCl↓

茜素氟蓝 pH4.3 F- 铈 蓝紫色

丙酸氯倍他索 水浴加热2min 丙酸倍氯米松 氧瓶燃烧

第二节 鉴别试验 Identification test 7、酯水解反应 适用： 本类药物C17或C21位上羟基的酯 原理： 醋酸酯、戊酸酯及己酸酯 戊酸雌二醇 醋酸可的松

第二节 鉴别试验 Identification test 小结: 特殊官能团与分析方法 A环△4–3–酮 C17–α–醇酮基 C17–β–羟基 C17–甲酮基 C17-乙炔基 A环为3–OH苯环 肾上腺皮质激素 + 雄性与蛋白同化激素 雌激素 孕激素 鉴别反应 UV、羰基试剂反应 还原性 可成酯 与亚硝基铁氰化钠反应 与硝酸银反应 UV、与重氮苯磺酸盐反应

第二节 鉴别试验 Identification test 三、制备衍生物测定熔点 （一）酯的水解 醇制KOH H2O水解 丙酸睾丸素 睾丸素 m.p.为150℃~ 156℃ （二）酯的生成 炔雌醇 m.p.201℃

第二节 鉴别试验 Identification test （三）酮肟的生成 HONH2 炔诺酮 炔诺酮肟 （四）缩氨基脲的生成 m.p.约195℃（分解） 苯丙酸诺龙 苯丙酸诺龙缩氨脲 m.p.约182℃（分解） H2NCONHNH2 回流

第二节 鉴别试验 Identification test 四、UV-ViS分光光度法 280nm左右 雌二醇 原 理 200-760nm有特征吸收 240nm左右 氢化可的松 醋酸可的松 方 法 可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小 20μg/ml丙酸倍氯米松的乙醇溶液→239nm→0.57~0.60;A239nm/A263nm→2.25~2.45

4 –3 酮型 1，6 –3酮 型 1，4 –3酮 型

ν 五、IR法 原料药 3750～3300cm-1 3300～3000cm-1 3000～2700cm-1 1900～1650cm-1

第二节 鉴别试验 Identification test 1、炔雌醇 结构特征： 酚羟基 C17 –OH C17 –乙炔基

3300cm-1 1615cm-1 1590cm-1 3610cm-1 酚羟基 3505cm-1 1505cm-1 醇羟基 苯环的骨架振动

第二节 鉴别试验 Identification test 2、黄体酮 结构特征： △４-3-酮 C17-甲酮基

C-H C=O 870cm-1 20位酮基 双键 1700cm-1 1615cm-1 1665cm-1 3位酮基

第二节 鉴别试验 Identification test 六、TLC法 七、HPLC 应用 甾体激素类药物制剂的鉴别 甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏） 方法 对照品法 结果 判断 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致 实例 丙酸睾酮注射液 苯丙酸诺龙注射液 地塞米松磷酸钠 甲睾酮

第二节 鉴别试验 Identification test TLC法 丙酸睾酮植物油注射液的鉴别 供试溶液：约含10mg丙酸睾酮→10ml无水乙醇→强力振摇→分层→无水乙醇溶液→离心→上清液； 对照溶液：丙酸睾酮对照品1mg/ml； 薄层板：硅胶GF254； 取样量：10μl 展开剂：二氯甲烷-甲醇（19：0.5）； 检视：254nm 对照品 供试品

第三节 特殊杂质检查 Detection of specific impurities 一、有关物质的检查 TLC和HPLC 杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。 其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。

第三节 特殊杂质检查 Detection of specific impurities 检查方法：（具有一定分离能力） 1、TLC法（高低浓度对比法） 判定方法：规定杂质斑点数目；规定杂质斑点颜色 eg：醋酸泼尼松中有关物质的检查 供试品溶液：4mg/ml三氯甲烷-甲醇(9:1) 对照品溶液：1ml→50ml→80μg/ml三氯甲烷-甲醇(9:1) →5μl 薄层板：硅胶GF254 展开剂：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 (385:60:15:2),晾干，105℃10min 显色剂：碱性四氮唑蓝显色 对照品 80μg/ml 供试品 4.0mg/ml 判断：供试液如显杂质斑点，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。

2、HPLC法（高低浓度对比法） 判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积 供试液1 mg/ml (甲醇) 供试品溶液的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照液的主峰面积的3/4 对照溶液0.02mg/ml(甲醇)5μl→HPLC

第三节 特殊杂质检查 Detection of specific impurities 二、游离磷酸盐的检查 醋酸地塞米松磷酸钠 杂质来源： 原理： KH2PO4 +(NH4)MoO4 → (NH4)3[P(Mo3O10)4] +1-氨基-2-萘酚-4-磺酸→磷钼酸蓝 740nm 方法：对照品比色法 供试品溶液：20mg→15ml水（25ml量瓶） 对照品溶液：标准磷酸二氢钾溶液(0.025mg/ml)4ml+11ml水（25ml量瓶） 显色剂：钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml 水定容→20℃放置30～50min →740nm测定 结果判断：供试品溶液的吸光度≤对照溶液的吸光度。 限量≤0.5%

第三节 特殊杂质检查 Detection of specific impurities 三、有机溶剂残留量的检查 GC eg：地塞米松磷酸钠 杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。 Ch.P规定：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％ 丙酮规定≤5.0% 供试液：0.16g→10ml量瓶→精密加内标溶液（正丙醇）2ml →水稀释至刻度→GC ； 对照液：精密量取甲醇约7.9mg+丙酮约79mg→ 10ml量瓶(水)→1ml+精密加内标溶液2ml →水定容10ml→GC.

第三节 特殊杂质检查 Detection of specific impurities 剧毒 四、硒的检查 杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。 方法： 结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度（0.005％～0.01％）。

醋酸氟轻松 检查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0±0.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（1→2）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基萘试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2′，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供＜A对。

第四节 含量测定 Assay 高效液相色谱 常 用 方 法 紫外分光光度法 四氮唑盐比色法 比色法 异烟肼比色法 柯柏比色法 非水溶液滴定法

一、HPLC法 USP、BP、JP均采用 第四节 含量测定 Assay 测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂。 方法：RP－HPLC（内标法） eg：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相 ODS，检测波长254nm 流动相 甲醇-水（65:35） 系统适用性试验：n>1000，黄体酮与内标R符合规定。 内标溶液：己烯雌酚约25mg→25ml量瓶(甲醇) 测定：供试品溶液：本品约25mg→25ml量瓶(甲醇)→5ml+内标溶液5ml →25ml(甲醇) →5μl→HPLC（对照液同法）

第四节 含量测定 Assay 对照液 供试液 黄体酮 己烯雌酚

二、UV-ViS分光光度法 第四节 含量测定 Assay （一）UV分光光度法 1、△４-3-酮 240nm（±） 醋酸甲地孕酮 二、UV-ViS分光光度法 （一）UV分光光度法 1、△４-3-酮 240nm（±） 肾上腺皮质激素 雄性激素 孕激素 炔雌醇 2、苯环 280nm（±） 雌激素 缺点：专属性不强

第四节 含量测定 Assay 示例：炔雌醚的含量测定 样品→50ml无水乙醇→ 5ml → 50ml无水乙醇→280nm 对照品→100μg/ml无水乙醇→280nm 280 360nm AR×W(1-干燥失重%) AX×CR×10-3 x100% B%=

（二） 比色法 1、 四氮唑盐比色法 第四节 含量测定 Assay （1）原理： 有色甲瓒 四氮唑盐 - a 强碱性 肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基 有色甲瓒 四氮唑盐 醇酮基 - a 17 C OH - 红四氮唑 [H] 三苯甲瓒↓深红 氯化三苯四氮唑（TTC）

第四节 含量测定 Assay （2）方法：对照品法 供试液 对照液 A 蓝四氮唑（BT） 双甲瓒暗蓝色 λmax 525nm 25 ℃ 氢氧化四甲基铵 对照液 供试液 A TTC 40～45′ 暗

第四节 含量测定 Assay 醋酸泼尼松龙软膏含量测定 标示量%=AXmR/(ARWB)x100% 计算 对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40～50分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。操作应避光。 计算 标示量%=AXmR/(ARWB)x100%

（3）影响因素 A. 基团对反应速度的影响 C11= O＞C11－OH C21－OH未酯化＞C21-OH酯化 酯基：三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯↓ 21 11

以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响。 第四节 含量测定 Assay B、溶剂和水分的影响 以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响。 C、O2与光线的影响 甲簪 避光、隔绝空气、快速、充N2 D、碱的种类及加入顺序 以氢氧化四甲基铵的结果最佳 加入顺序：皮质激素溶液 四氮唑盐 碱试液

油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT的显色反应有干扰，要先分离后测定。 第四节 含量测定 Assay E. 温度与时间 Ch.p 室温（25℃）暗处反应40～45 min t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓ F. 干扰物的影响 油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT的显色反应有干扰，要先分离后测定。

2、异烟肼比色法 + A 第四节 含量测定 Assay （1） 原理 C3-酮基+异烟肼 异烟腙（黄） 420nm （2）方法：对照品法 肾上腺皮质激素 雄性激素 蛋白同化激素 孕激素 酸性 （1） 原理 HCl C3-酮基+异烟肼 异烟腙（黄） H2O 420nm （2）方法：对照品法 H2O + 60 ℃ 异烟肼 无水甲醇 对照液 供试液 A 暗60′

倍他米松磷酸钠的含量测定： 供试品溶液：约含倍他米松20mg→50ml(甲醇)； 对照品溶液：倍他米松磷酸钠（约含倍他米松20mg） →50ml(甲醇)； 各1ml →20ml异烟肼溶液0.75mg/ml →60℃保温1h →定容至25ml →420nm

第四节 含量测定 Assay （3）影响因素 A.反应速度（反应专属性） △4-C3=O＞C17= O 、C20= O C11= O 不反应 B. 溶剂的选择 异烟肼盐酸盐→受溶解度的影响 稳定性好 呈色强度较无水乙醇中高 对植物油的溶解度小 无水甲醇 无水乙醇

第四节 含量测定 Assay C.水分、温度、O2与光线的影响 含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓ 具塞玻璃容器，O2与光线对反应的影响不大 t℃ ↑ → ν↑ D.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度 酸:异烟肼 = 2:1 最大A

3、Kober反应比色法 第四节 含量测定 Assay （1）原理 桃红 黄色 雌激素 λmax=465nm 515 465 A △ 2 O H 乙醇 - 4 SO λmax=465nm 515 465 450 500 550 nm A Kober 反应吸收光谱 λmax=515nm 炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量

雌二醇-3-甲醚

第四节 含量测定 Assay 复方炔诺孕酮滴丸中炔雌醇的含量测定 供试品溶液：10丸→20ml量瓶→ 12ml乙醇→微温溶散→定容→滤过→续滤液； 对照品溶液：0.15mg/ml炔诺孕酮+15μg/ml炔雌醇的乙醇溶液； 各2ml →具塞锥形瓶→冰浴冷却30s →8ml硫酸-乙醇（4：1） →冰浴冷却30s →室温20min →530nm

第四节 含量测定 Assay 三、非水溶液滴定法 0.3g→20ml冰醋酸溶解→结晶紫指示液1d→高氯酸（0.1mol/L）滴定→蓝绿色 空白试验 米非司酮

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