动物性食品微生物检验 动物性食品中布氏杆菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 了解布氏杆菌的生物学特性 掌握布氏杆菌检验方法 掌握布氏杆菌的卫生评价与处理 能对可疑病料进行处理 能通过凝集试验鉴定布氏杆菌

布鲁氏杆菌 布鲁氏杆菌是布鲁氏杆菌病的病原体，布鲁氏杆菌病为一种人畜共患传染病，于1860年发现于地中海（马尔他岛），故又称为地中海弛张热或马尔他热。1887年布鲁氏首次分离到病原体，后称为布鲁氏杆菌。

本病的易感动物范围很广，如羊、牛、猪、水牛、野牛、牦牛、羚羊、鹿、骆驼、野猪、马、狗、猫、狐、狼、野兔、猴、鸡、鸭以及一些啮齿动物等。但主要是羊、牛、猪。布氏杆菌病原体可通过胎盘、羊水、流产胎儿、乳汁、阴道分泌物、精液等排出体外，通过皮肤伤口、消化道、呼吸道、眼结膜、交配等途径感染。 布鲁氏杆菌共有6个种，主要有牛、羊、猪布鲁氏杆菌，沙林鼠布鲁氏杆菌，绵羊副睾布鲁氏杆菌及犬布鲁氏杆菌，后三种很少见到。在我国引起布氏杆菌病的主要为羊布鲁氏杆菌，其次为牛、猪布鲁氏杆菌。

一、生物学特性 形态与染色特性：本菌为球杆状或短杆状细小的G－菌不形成芽胞、鞭毛、个别菌株可产生荚膜，柯兹罗夫斯基染色法（即柯氏染色法、沙黄-孔雀绿或碱性美兰），本菌染成红色，其它细菌及组织染成绿色（蓝色）。

培养特性 ： 本菌为需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH值为6.8～7.2。 对营养的要求严格，生长缓慢，另外硫胺、烟酰胺、甘油、复合氨基酸、泛酸钙和赤藓醇也可促进某些布氏杆菌的生长。 初次分离时，牛布氏杆菌必须在含有5～10%CO2环境中才能生长，但在人工培养基上移种几代后就不需要CO2。

在培养基上的生长情况 在血清肝汤琼脂上形成湿润、圆形、隆起、有光泽、边缘整齐的无色小菌落； 在血琼脂培养基上，形成灰白色、圆形、边缘整齐、不溶血的小菌落； 在马铃薯斜面上，经2～3天后长出水溶性微棕黄色菌苔。

生化特性 ：布鲁氏杆菌分解糖的能力因种不同很不一致。本菌不分解甘露醇，不产生靛基质，不液化明胶，不凝固牛乳，V-P试验和MR试验为阴性，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐（绵羊布氏杆菌除外），不利用枸椽酸盐，能分解尿素和产生硫化氢，但菌种活力不同产生的量也不同。

抗原性：布氏杆菌的抗原结构较复杂，其抗原有几种，一种为完整菌体凝集抗原，所有的S型菌株均含有A抗原和M抗原成分，均为凝集抗原。 抵抗力：布氏杆菌对外界环境的抵抗力较强。在水、土壤中可存活几周到几个月。对冷冻抵抗力也较强，在-15℃可存活43天。在肉、乳品及羊毛中能存活14个月，在胎儿体内可存活6个月。直射日光0.5～4小时可将其杀死。本菌对湿热较敏感，60℃ 30分钟死亡，100℃立即死亡。本菌对消毒剂较敏感，2%石炭酸或2%来苏儿不超过3分钟即死亡。

临床症状： 母畜最显著的症状是流产。 公畜常见睾丸炎及附睾炎。 临诊上常见的症状还有乳房炎、支气管炎、关节炎及滑液囊炎而引起跛行。

二、检验 布氏杆菌临床表现多种多样，一般不典型，难与其它疾病鉴别，微生物学检验具有重要意义。包括细菌学检验、血清学试验和变态反应诊断等。 样品的收集与处理:采集人的血液、骨髓、尿液等及病畜流产的整个胎儿或胎儿的内容物、羊水、胎盘的坏死部分、阴道分泌物以及乳汁和尿液等作为检样。

检验方法 细菌的分离培养 血清学检验 乳汁环状试验 动物试验 变态反应检查 结果 报告

1.细菌的分离培养 血液及骨髓穿刺液：取静脉血（或病畜流产胎儿的心血）5mL，接种两瓶肝浸液（或胰胨肉汤）或固体双相培养瓶中。

乳汁：洗净家畜的乳房及乳头，用酒精消毒后，挤去最初几滴乳汁，然后将乳汁入灭菌试管中，以3000转/分钟离心10分钟，取沉渣和表层奶皮接种在两个选择性布氏杆菌培养基上，或接种豚鼠。 动物的羊水、组织和死胎：动物死胎或流产胎儿可先用清水洗去泥土污物，然后浸于3%来苏儿溶液中30min，取出用纱布拭干，以无菌手续解剖，取胃肠内容物、肺、肝、脾、胎粪等直接涂布在肝浸液、吐温葡萄糖琼脂或胰胨琼脂平板上。

以上增菌培养及分离培养所用培养基均需一式两份 一份在5%～10%CO2环境中培养。 一份在普通环境中培养。 37℃，10d，如无细菌生长，可报告阴性，血培养可延长至4周。

2．血清学检验-试管凝集试验 试管凝集试验(最常用的诊断方法)： 试验方法：将被检血清在试管内用0.5%石炭酸生理盐水进行稀释，然后加入布氏杆菌抗原、放37℃下感作，取出判定血清的凝集滴度。

判定标准： 牛、马、骆驼、人血清1：100或更高，出现“++”或以上判为阳性，1：50出现“++”以上时判为疑似。 羊、猪、狗血清1：50或更高，出现“++”或以上判为阳性，1：25出现“++”以上时判为疑似。 判定疑似反应的，过3～4周后重检，重检仍为疑似时，牛和羊按阳性处理；猪和马应结合该畜群有无布氏杆菌病流行，予以判定。

2．血清学检验-平板凝集试验 此法简便易行，适宜于现场检疫。本法有一定特异性，比较敏感，但具有一定假阳性，故不宜作最后诊断。 虎红平板凝集试验：此法简便、快速易行，具有较好特异性，有一定的敏感性，可用于大面积检疫。

2．血清学检验-平板凝集试验 其操作方法：在玻片上加0.03mL被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03mL，摇均或用牙签混匀，在5分钟内判定结果。 结果判定：同平板凝集试验。

2．血清学检验-琼脂扩散试验 操作方法： 制备琼扩板 打孔 加样 反应 结果判定：两孔间出现清晰的一条或数条沉淀线时为阳性 白色沉淀线

3.乳汁环状试验 试验方法：取被检鲜奶1mL加入小反应管中，再滴一滴苏木精染色的布氏杆菌环状抗原于其中混匀。 反应：37℃，45min

结果判定： 乳汁中有抗体，则出现凝集，随乳脂飘浮于乳汁表面，呈深蓝色环，乳柱呈白色，应判为强阳性。 乳脂有蓝色环，乳柱呈不完全白色为阳性 乳脂层呈淡蓝色环，乳柱亦为浅蓝色为弱阳性 乳脂层无色，乳柱呈蓝色为阴性。

4.动物试验 将病畜或病人的血、尿、乳等标本，通过不同的途径使豚鼠发生全身感染，利用豚鼠对本菌的高度敏感性（家兔及小白鼠亦可）做动物试验，其分离阳性率比从标本直接分离培养为高。

5．变态反应 机体被本菌感染患病后，出现凝集反应和补体结合反应时间较长。发病20～25天可出现阳性反应，并可维持10年以上。对于隐性感染、患病已愈及接种菌苗的机体，较长时间可出现阳性反应，因此，变态反应试验可供早期诊断、普查及追溯诊断时的参考。

6．结果报告 综合试验结果报告。

三、卫生评价与处理 肉品检验时一旦检出布鲁氏菌阳性，患病动物的肉尸、内脏及其流产胎儿、胎衣、排泄物、乳、乳制品等按照GB16548-2006《病害动物和病害动物产品生物安全处理规程》的规定进行无害化处理。

四、公共卫生 人类感染布鲁氏菌病，传染源主要是患病动物； 一般不由人传染于人，所以人类布鲁氏菌病的预防与消灭，有赖于动物布鲁氏菌病的预防和消灭。

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