遗传病的诊断 Diagnosis of Genetic Disease 井冈山大学医学院 生物学与医学遗传学教研室

第一节 临症诊断和症状前诊断 临症诊断（symptomatic diagnosis）是根据患者的各种临床表现进行检查、确诊和判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。 症状前诊断（presymptomatic diagnosis）则是对遗传上异常的个体采用各种措施，使他们在出现症状前从遗传上予以确认。

一、病史、症状和体征 病史 症状与体症

二、家系分析 根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，大大有助于区分单基因病和多基因病，以及遗传方式。

三、细胞遗传学检查 细胞遗传学检查，即染色体检查与核型分析，是应用较早的遗传病诊断手段。随着显带技术，特别是高分辨染色体显带技术的出现和改进，能够更准确地判定和发现更多的染色体畸变，确诊新的微小畸变综合征。

四、生化检查 生化检查是遗传病诊断中的重要辅助手段，包括临床生化检验和针对遗传病的特殊检查，主要是对由于基因突变所引起的酶和蛋白质定量和定性分析，对单基因病和先天性代谢病进行诊断。

五、基因诊断 利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断。

第二节 产前诊断和植入前诊断 产前诊断（prenatal diagnosis）是以羊膜穿刺术和绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学和生化检查分析，对胎儿的染色体和基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段。

一、产前诊断的对象 ①夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或生育过染色体病患儿的夫妇； ②35岁以上的孕妇； ③夫妇之一有开放性神经管畸形，或生育过这种畸形患儿的孕妇； ④夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇； ⑤X连锁遗传病致病基因携带者孕妇； ⑥有习惯性流产史的孕妇； ⑦羊水过多的孕妇； ⑧夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇； ⑨有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。

二、产前诊断的方法 产前诊断的常规方法有无创性和有创性两类，无创性方法有B超检查，孕妇血液与尿液检测，CT、X线和核磁共振等；有创性方法有羊膜穿刺、绒毛取样和胎儿镜等。

B超 是一种相对安全无创的检测方法，是首选的诊断方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，可对多种遗传性疾病进行早期诊断，这些疾病包括，神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇、腭裂，颈部淋巴管瘤；先天性心脏病；支气管、肺部发育异常，胸腔积液；肢体缺陷；先天性单侧肾缺如、多囊肾；先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。

羊膜穿刺技术 是产前诊断的基本方法之一，即在B超的监护与引导下，无菌抽取胎儿羊水，对羊水中的胎儿脱落细胞培养，进行染色体、基因和生化分析。例如，羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可能有脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。羊膜穿刺操作一般在妊娠15～17周进行，发生感染、流产及其他妇科合并症的风险相对较小（约1%）。

羊膜穿刺示意图

绒毛取样法 在妊娠早期诊断中最为常见，一般于妊娠10～11周进行。该技术也是在B超监护下，用特制的取样器，从孕妇阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样部位后，吸取绒毛枝。绒毛取样的优点是检查时间早，根据检测结果认为有必要进行选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦相对较小。缺点是取样标本容易被污染，胎儿和母体易感染和操作不便等，引起流产的风险是羊膜穿刺法的2倍。

绒毛样本可用于诊断染色体病，代谢病，胎儿性别鉴定，生化检测和DNA分析。 取 样 法 示 意 图 绒毛样本可用于诊断染色体病，代谢病，胎儿性别鉴定，生化检测和DNA分析。

脐穿刺 是在B超的监护下，用细针经腹壁、子宫壁进入胎儿脐带，并抽取胎儿血液样本进行诊断。本方法适宜妊娠18周进行，常作为因错过绒毛或羊膜穿刺取样最佳时机，或羊水检查失败的补救措施，还可检测胎儿血液系统疾病，先天性免疫缺陷等。

胎儿镜检查 又称羊膜腔镜或宫腔镜检查。宫腔镜进入羊膜腔后，直接观察胎儿是否有畸形、性别和发育状况如何，可以同时抽取羊水或胎儿血样进行检查，还可进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最为理想的方法。但由于操作困难和易引起多种并发症，目前还不能被广泛接受。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠18～20周。

分析孕妇外周血中的胎儿细胞以及游离的胎儿DNA或RNA

三、植入前诊断 PGD技术是指在体外受精的胚胎，发育到4～8细胞期，通过显微操作技术取出单个卵裂球细胞，应用PCR、FISH等技术进行快速的遗传学分析，包括染色体检查、特定基因检测，性别鉴定，正常的胚胎植入母体子宫。

第四节 分子诊断 利用分子生物学技术，检测DNA、RNA结构或基因表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断（gene diagnosis）。

1978年，华裔美国学者简悦威（Yuet-Wai Kan）首次采用DNA重组技术对血红蛋白病进行产前诊断，开创基因诊断的先河。目前，基因诊断早已进入欧美各国的临床应用，不仅针对遗传性疾病，而且用于对一些感染性疾病和肿瘤的诊断。

基因诊断具有以下特点： 以特定基因为目标，检测基因的突变和表达信息，特异性强； 采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，微量样品即可进行诊断，灵敏度高； 可用于尚无出现临床表现前，胎儿的出生前诊断，群体筛查等，应用广泛； 检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。

一、基因诊断的主要方法 基因诊断主要采用核酸分子杂交、PCR和DNA测序等技术。

核酸分子杂交技术 是检测样品中是否存在相应的基因以及相应基因的表达状态等。其中Southern印迹法主要用于基因组DNA的分析，Northern印迹法用于检测样品中RNA的种类和含量。

斑点印迹杂交 把待检测的核酸样品点在尼龙膜上，变性后与标记的探针进行结合反应，经过显色和显影后检测杂交信号的强度，与对照比较后确定所测核酸量的高低。根据尼龙膜上所点核酸样品的种类不同，分为DNA dot blotting和 RNA dot blotting。

原位杂交 把组织或细胞样品经过适当处理，用探针与核酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，可以确定被检核酸在组织或细胞，以及中期染色体上的定位，具有重要的生物学和病理学意义。

PCR-ASO ASO为等位基因特异性寡核苷酸杂交法的简称。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的DNA分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合体或杂合体 。

基因芯片技术 基因芯片技术是近年来发展迅速的大规模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龙膜等，形成矩阵点。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描，经计算机系统分析处理所得资料，对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。

基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理有价值的生物样品，精细地研究各种状态下分子结构变异，了解组织细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于发展和优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临床诊断。

其他常用的技术 PCR-RFLP PCR 利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增； 酶切 利用某些限制性内切酶消化PCR产物，如PCR产物中 含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开； 电泳 利用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的 PCR产物，根据电泳图谱判断结果。

PCR-SSCP 当双链DNA变性为两条单链后，各自会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现各自电泳条带。如果DNA序列发生变化，甚至只有一个碱基变化，空间构象也有可能发生变化，电泳条带也随之变化。

PCR-SSCP

RT-PCR 以mRNA为模板合成cDNA，再进行PCR，用于基因表达水平的检测和分析。

（denaturing high-performance liquid chromatography） DHPLC即变性高效液相色谱分析 （denaturing high-performance liquid chromatography） 几乎为每一个基因诊断室所必备。DHPLC用于DNA序列变异的检测，其本质上是用离子对反相HPLC进行DNA杂合双链片段分析。

Western blot法 Western blot印迹技术是检测特定蛋白质的方法，可用于某种与遗传病相关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的dystrophin蛋白合成异常，采用Western blot法可对患者dystrophin蛋白进行检测。

二、基因诊断技术的应用 基因诊断在遗传病中的应用 例如：镰状细胞贫血的基因诊断 酶解正常人DNA和患者DNA，用标记的珠蛋白基因为探针作Southern杂交

镰状细胞贫血的基因诊断 限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一种核苷酸）， 切割正常DNA产生1.1kb 珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时， 由于AT破坏了MstⅡ的位点，便形成1.3kb 珠蛋白的DNA片段。

例如：血友病A的基因诊断 PCR技术与RFLP相结合的方法。 首先用PCR技术将包含突变DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解，电泳后直接检测多态性位点的状态。

基因诊断在肿瘤中的应用 ras基因突变的检测 ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子。 p53基因的检测 目前常用PCR法进行检测p53突变的热点是外显子5-8，一般可先选用外显子5-8的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一初步检测p53基因突变的方法为PCR-SSCP，然后测序。

帕金森病基因诊断 家系研究 连锁基因的研究 4号染色体相连锁的呈常染色体显性遗传的PD（PARKI） 6号染色体相连锁的呈常染色体隐性遗传的少年型PD（PARK2） 2号染色体相连锁的呈常染色体显性遗传的PD（PARK3） 散发性PD遗传易感性的研究

[复习思考题] 一、名词解释 1、基因诊断（gene diagnosis） 2、RFLP 3、STR 4、基因治疗(gene therapy) 二、染色体检查的指征。 三、基因诊断特点及方法分别有哪些？ 四、系谱分析应注意的事项 五、染色体检查适应症