第十四章 细胞融合技术 化学与生命科学学院
细胞融合（cell fusion）：是指两个或更多个不同细胞在助融剂的作用下，通过膜融合形成具有新遗传特性的杂种细胞的技术。 按照技术过程的不同，细胞融合可以分为： 细胞融合；原生质体融合；细胞拆合
显微镜下细胞融合过程
融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解
几种细胞融合成功的例子 生物种类 细胞来源 成功年代 烟草两个种间 苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花 大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠 叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1972
植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图
细胞融合的意义 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。
体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
第一节 动物细胞融合技术
概 述 一. 免疫学知识 人体和动物都有免疫系统，包括非特异性免疫和特异性免疫。 概 述 一. 免疫学知识 人体和动物都有免疫系统，包括非特异性免疫和特异性免疫。 非特异性免疫主要有宿主的屏障，吞噬细胞，抗菌物质，以及炎症反应。 特异性免疫又分为细胞免疫和体液免疫。
细胞免疫 主要是指机体受到异己物质（抗原）的刺激后，一类小淋巴细胞——依赖胸腺的T细胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。
体液免疫 是当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞——B淋巴细胞进行增生和分化为浆细胞，进而合成各种免疫球蛋白(抗体)，然后在体液中发挥免疫作用的过程。
二. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性 体内的B淋巴细胞可以被外来的抗原所激活并产生相应单一、均匀的特异性抗体，但在体外无法进行繁殖和传代；（短命） 骨髓瘤细胞在体外具有很强的繁殖能力；（长命） 将二者进行细胞融合，制成杂交瘤细胞，就可以在体外持续分泌出成分单一的特异抗体，即单克隆抗体。
细胞融合技术： 1984年Nobel医学奖 分泌抗体 短命 不分泌抗体 长命 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 细胞融合 分泌抗体 长命 杂交瘤细胞 1984年Nobel医学奖
单克隆抗体 单克隆抗体是将能产生抗体的细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系，而产生的抗体。 由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，所以称为单克隆抗体。
一、淋巴细胞的制备 特定目标抗原 动 物 免疫 脾脏中B淋巴细胞 刺激 能分泌针对于该抗原的特异性抗体 B淋巴细胞 大量增殖 加强免疫
1. 常用的免疫动物Balb/c小鼠。 免疫方法 常规免疫法的免疫途径 常规免疫法 “稳妥；优势克隆” 脾内一次性免疫法 “省时；省抗原” 常规免疫法 “稳妥；优势克隆” 脾内一次性免疫法 “省时；省抗原” 短程免疫法 “省时” 体外免疫法 “操作繁琐” 常规免疫法的免疫途径 皮下注射 腹腔注射 静脉注射
2. 常规免疫法免疫程序： 第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射) 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射) 第3次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (静脉注射) 采集脾脏细胞
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 1. 细胞融合 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 聚乙二醇（PEG）细胞融合：浓度40-50% 分子量4000, pH8.0, 38℃, 1min
融合方法: 取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞(2×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在1分钟以内，然后用培养液将聚乙二醇融合液缓缓稀释。
2. 杂交瘤细胞的筛选： 筛选出 脾细胞 骨髓瘤细胞 (B淋巴细胞) 不能长期存活 杂交瘤细胞 脾细胞/脾细胞 骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞
3.HAT培养基筛选原理 H DNA A T 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 B淋巴细胞：HGPRT+，TK+ 存活 (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) H T 外源性途径(旁路途径) DNA 内源性途径(主要途径) 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 A 外源性途径(旁路途径) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞：HGPRT+，TK+ 存活 骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK- 死亡
4. HAT培养基的筛选 （每2-3天换液1/2换液） 融合后细胞混合液 HAT培养基 HT培养基 正常培养基 滋养细胞 2 weeks later 1 week later
细胞培养瓶
细胞培养瓶
细胞培养板
细胞培养皿
三、 抗体的检测 要求： 常用方法： 简便、快速、敏感; 酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法 (radio immuno assay, RIA)
酶联免疫吸附法(ELISA) 技术原理 底物 有色产物 酶标仪检测 酶 第2抗体 第1抗体 待检杂交瘤培养上清液 抗原
四、克隆化 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体 常用的大规模培养方法： 动物接种法 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 大规模细胞培养法 利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。
杂交瘤技术操作流程图解 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体
第二节 原生质体融合技术
一、仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： ①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。
病毒促使细胞融合的主要步骤如下： 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
二、聚乙二醇（PEG）法 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。 PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生 最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
电融合诱导法原理示意图
第三节 杂种细胞的筛选 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 第三节 杂种细胞的筛选 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。 多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。
常用的杂种细胞筛选方法 基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选
第四节 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
一、何谓单克隆抗体？
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。
Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein
二、杂交瘤技术的基本原理
三、杂交瘤细胞的制备 （一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基 骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
HAT培养基 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T） 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
（二）免疫小鼠 免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。
（三）脾细胞的制备 (1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。
（四）细胞准备 （1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞； （3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸 净多余上清。
（五）细胞融合 (1)将1ml 40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管； (7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。
（六）融合后细胞培养 (1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天 半量换液一次； (2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液； (3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明； (4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。
HAT培养基 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T） 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
（七）抗体检测 免疫荧光试验 放射免疫试验(RIA) 联免疫吸附试验(ELISA)
（八）单克隆抗体的大量制备 体内法 培养法
四、单克隆抗体的应用 单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。 利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。 单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。 单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。
第五节 人源单克隆抗体 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。
本章小结 细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融 合形成单个细胞的过程。 细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理法（电融合法）。 杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。 基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。
植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞
动物细胞融合实验使用的小白鼠