实验一 显微镜的构造和使用方法与细菌的革兰氏染色

1．实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造 、学会显微镜使用和维护方法； （2）掌握细菌涂片技术、革兰染色方法及其原理； （3）熟悉细菌基本形态。

2.实验内容 （一）普通光学显微镜的构造  分光学和机械两大部分。光学部分包括接目镜、接物镜、集光器、光源等；机械部分有镜筒、镜臂、镜座、旋转器、载物台、光圈、倾斜关节、调节螺旋、次台等。

（二）油镜使用的基本原理 油镜头的晶片细小，进入镜中的光亮亦较少，其视野较用高倍镜时暗。当油镜和标本间介质为空气时，因空气与玻璃的折射率不同，会有一部分光线被折射而不能进入油镜内，使视野更暗，若在镜头与标本之间放上与玻璃的折射率相同的油类，如香柏油等，则光线不发生折射，从而增加视野的照明度。

（三）显微镜的使用方法 1.观察前的准备  2、低倍镜观察  3、高倍镜观察  4、油镜观察  5、用低倍镜和高倍镜观察酵母标本片，油镜观察球菌、杆菌、螺旋菌的染色标本片。

（四）简单染色法与革兰氏染色法 （1）观察细菌的基本步骤：先用低倍镜再用高倍镜 （2）革兰氏染色法操作： 涂片 →干燥 →固定 →草酸铵结晶紫出染（1min）→水洗 →碘液媒染（1min）→水洗 →95%乙醇脱色（30s）→水洗 →沙黄复染（1min）→水洗 →滤纸吸干 →油镜检查 4．注意事项 （1）细菌制片时不宜涂厚。 （2）严格保证脱色和染色时间。 （3）使用显微镜注意保护镜头。

思考题 1、绘出你所观察到的细菌形态图。 2、观察细菌时为何使用油镜？它与普通物镜在使用方法上有何不同？ 3、光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数？显微镜的放大倍数越高，分辨力越高吗？为什么?举例说明。 1、绘出你所做的革兰氏染色制片中细菌的形态图，并标明总放大倍数及染色反应结果。 2、详叙革兰氏染色的原理及操作方法，染色时应注意哪些问题？

实验二 培养基的制备

1．实验目的与要求 （1）掌握一般培养制备原理及原则，并学会配制一般普通培养基操作过程； （2）学习微生物实验室常用灭菌设备的使用方法； （3）学习玻璃器皿的包扎方法。 2．实验内容提要 （1）液体培养基的制备 （2）固体培养基的制备 （3）微生物实验室常用灭菌设备的使用方法和灭菌方法 （4）玻璃器皿的包扎方法 （5）棉塞的制作方法

3．实验操作要点 1配料 → 温水溶解 → 校正pH值 → 煮沸 → 加琼脂融化 → 过滤 →分装 →加盖棉塞 →包扎 →灭菌 →无菌检查（液体培养基的制备时不加琼脂） 2微生物实验室常用灭菌设备的使用 （一）   手提式高压蒸汽灭菌器  （二）   干热灭菌箱 （三）紫外线灭菌室 

4．注意事项 （1）配制培养基要注意操作程序，尤其需先校正pH值，后加琼脂。 （2）湿热灭菌时，高压锅要注意排尽空气；灭菌后压力降至0以下才能打开灭菌锅。 （3）干热灭菌时，105℃关闭气门；灭菌后温度降至60℃以下才能打开舱门。

思考题 1．配制普通营养琼脂培养基300-500ml，操作高压蒸汽灭菌全过程，灭菌后摆斜面和倒平板，制成斜面培养基和平板培养基。 2．包扎平皿、吸管，制作试管和三角瓶棉塞，并进行干热灭菌。 3．培养基制备的原则及种类？如何调节培养基的PH值？调节是应注意哪些问题？ 4．高压蒸汽灭菌之前，为什么要放尽器内冷空气？灭菌后，压力未降至零时为何不能开盖？ 5．高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所用温度低，却又相同灭菌效果？

实验三.微生物的分离培养与纯培养

1．实验目的与要求 学习和掌握微生物各种分离方法及其纯粹培养方法。 2．实验内容提要 （1）平板划线分离； （2）可疑菌落的镜检和纯培养。

3．实验内容 （1）平板划线分离； 此法为细菌和酵母菌最常用分离培养法。平板划线凡是甚多，随个人习惯而异，其目的均是使检样作适当的稀释，以求获得独立菌落（既由一个菌繁殖而形成的孤立群落），防止发育成菌苔（既由两个或两个以上菌体繁殖而成的群落），以便于观察菌落性状，浆目的菌分离与纯培养。

（2）可疑菌落的镜检和纯培养。 1.菌落性状的观察及选择 2.平板接种斜面纯培养法

4．注意事项 （1）平板划线分离时，待测样品应适当稀释，使细胞分散容易得到单菌落。 （2）平板划线分离操作时，勿划破培养基表面。 （3）挑取中等大小一半可疑菌落镜检，另一半进行纯培养。

5、作业与思考题 1.采用平板划线分离法和平板接种斜面法，从大肠杆菌和四联球菌（或微球菌）的混合菌液中，分离纯化出大肠杆菌。所用分离培养基为普通营养琼脂。 2.同上述操作，从被杂菌污染的酸奶发酵剂中分离纯化出保加利亚杆菌或嗜热链球菌。所用分离培养基为乳清琼脂培养基。 3.将所分离的目的菌菌落进行革兰氏染色并绘出细胞形态图与描述菌落特征。 4.详述平板划线分离操作过程和斜面接种方法。如果接种后经培养未长出菌落或菌苔，是何原因？ 5.一般微生物的接种方法有几种？用途？

实验四 生理生化反应试验

1.实验目的与要求 根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。 2.实验内容 （1）糖类发酵试验； （2）甲基红试验； （3）维培二氏试验； （4）吲哚试验； （5）柠檬酸盐试验； （6）H2S产生试验。

3.实验操作要点 取样→平板划线分离→可疑菌落镜检→纯培养→半固体培养基的穿刺培养（或固体斜面培养） 4.注意事项 （1）在糖类发酵试验时，穿刺培养注意穿刺线不能完全穿透培养基。 （2）甲基红实验时，不要过多滴加甲基红指示剂，以免出现假阳性反应。 （3）缓慢滴加吲哚试剂，防止出现假阴性。

5.结果与思考题 1.将实验结果填于表6-1中。 附：（1）糖发酵试验结果记录：“+”——产酸；“”——产酸、产气“”——阴性。其他试验结果：“+”——阳性反应；“-”阴性反应。 2.细菌的生化反应试验意义何在？要对一个未知菌进行分类鉴定，通常要做哪几方面工作？ 3.吲哚是怎样产生的？做吲哚试验可用什么样的合成培养基代替蛋白胨水？ 4.如果NO2反应也是阴性的，这种细菌有无硝酸盐还原力？ 5.M·R反应、V-P反应、吲哚试验的反应物、产物、结果？ 6.吲哚（Indol）试验，V-P试验，柠檬酸盐（Citrate）利用试验，甲基红（M·R）试验，又简称什么试验。 7.利用石蕊牛乳试验，可以观察到试验菌的哪些特性？

实验五 霉菌的小室载片培养

1.实验目的与要求 掌握霉菌的小室载片培养法，以便更好地观察基个体形态。 2.实验内容提要 霉菌的小室载片培养方法

3.实验操作要点 载玻片→滴一滴培养基→接种→盖上盖玻片→置于小室培养。 4.注意事项 （1）小室培养注意压片时用力均匀，避免培养基移动。 （2）接种注意将霉菌接种于培养基的周围。 （3）注意保持小室的湿度。

5实验作业 1.采用试管斜面培养与平板培养法培养根霉、毛霉、黑曲霉、青霉。 2.采用小室载片培养法培养黑曲霉、青霉，并详述小室载片培养法的操作过程。所用分离培养基为乳清琼脂培养基。 3.将所分离的目的菌落进行革兰氏染色并绘出细胞形态图与描述菌落特征。 4.详述平板划线分离操作过程和斜面接种方法。如果接种后经培养未能长出菌落或菌苔，是何原因？ 5.一般微生物的接种方法有几种？用途？

实验六 食品中常见菌类的观察

1.实验目的与要求 观察并描绘食品中常见微生物的菌落形态和菌体形态。 2.实验内容提要 （1）细菌的菌体形态和菌落观察； （2）水浸片法观察酵母菌的菌体形态； （3）霉菌和酵母菌菌落形态观察。

3.实验操作要点 （1）细菌的革兰氏染色，观察菌体形态。 （2）水浸片法：载玻片→滴一滴生理盐水→接菌→盖上盖玻片→镜检 （3）细菌及酵母菌菌落形态描述包括：大小、颜色、隆起度、边缘、光泽、透明度、表面形状、形状、质地、味道等 （4）霉菌菌落形态观察描述包括：大小、颜色、组织状态 4.注意事项 （1）仔细观察并详细描述菌落特征； （2）水浸片法加盖玻片时注意防止气泡产生。

5.结果与思考题 1.描述所观察细菌的菌落特征，并绘图说明其个体形态特征。 2.绘图说明你所观察的酵母菌的个体形态特征？水浸制片时应注意什么？ 3.根据观察结果绘图说明根霉，毛霉，曲霉（低倍镜下），青霉（高倍镜G）个体形态特征，并标明结构名称。 4.描述上述四类霉菌的菌落特征。 5.列表说明青霉属与曲霉属，毛霉属与根霉属在形态上的异同。 6.你如何根据显微镜下观察结果及菌落形态区分上述四类霉菌。 7.你观察到的青霉与曲霉，毛霉与根霉的菌丝有无隔膜？它们各属于真菌类的哪一纲？

实验七细菌的平板菌落总数测定

1.实验目的与要求 学习并掌握稀释倾注法检验菌落总数的程序和方法。 2.实验内容提要 奶粉样品菌落总数的测定。

3.实验操作要点 无菌称样→系列稀释→加样→倒平板→恒温培养→计数→报告 4.注意事项 （1）称取样品时注意无菌操作。 （2）系列稀释时，注意吸管尖端不要触及管内稀释液。 （3）倒平板时琼脂温度适宜，并立即混匀。

5.实验结果与思考题 1为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？ 2为要使平板菌落数计算准确，需要掌握那几个关键？并说明理由。

实验八.大肠菌群测定

1.实验目的与要求 熟悉并掌握大肠菌群检验程序及方法，进一步了解其原理。 2.实验内容提要 奶粉样品大肠菌群测定。

3.实验操作要点 无菌称样→系列稀释→乳糖胆盐发酵→EMB鉴定→复发酵试验→报告

4.注意事项 （1）称取样品时注意无菌操作。 （2）系列稀释时，注意吸管尖端不要触及管内稀释液。 （3）必须进行复发酵实验才能确定阳性管数。

实验九 微生物显微镜直接计数 统他好儿童

1.实验目的与要求 学习直接涂片计数法和利用血球计数器进行微生物计数方法。 2.实验内容提要 （1）直接涂片计数； （2）血球计数器计数。

3.实验操作要点 （1）直接涂片法：乳酸菌样品→倍比稀释→涂片→染色→镜检→计数 （2）血球计数法： 酵母菌样品→倍比稀释 ↓ 血球计数器→盖上特制的厚盖玻片→加样→静置→显微镜计数

4.注意事项 （1）直接涂片操作时，取菌样0.01ml时要精准，而且精确涂布于1平方厘米格内，否则菌体计数误差极大。 （2）血球计数操作时，应静置数分钟，应避免菌体流动，影响菌体计数。 （3）计数时注意计数显微镜视野中不同深度的菌体。 （3）物镜测微尺使用时先以低倍镜寻找测微尺位置，再测定油镜镜头尺寸。 （4）血球计数器、物镜测微尺使用后，勿用硬物洗刷。

5.思考题 同一种菌液用血球计数器和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一致？

实验十.乳酸菌的性状观察 与发酵剂的制作

1.实验目的与要求 了解乳酸菌某些品系的个体形态与菌落特征，掌握乳品发酵剂一般制作程序及其品质鉴定方法。 2. 实验内容提要 （1）乳酸菌个体形态和菌落特征的观察 （2）乳酸菌种选择与活化 （3）乳品发酵剂制作

3.实验操作要点 （1）乳酸菌个体形态特征观察时，革兰氏染色涂片不宜过厚，且乙醇脱色时间控制应适宜，否则不宜辨认菌体。 （2）乳品发酵剂制作 菌种 →活化 →原培养物 →中间酵剂→母发酵剂 4.注意事项 （1）乳品发酵剂制作过程要注意无菌操作。 （2）发酵时间不宜过长，否则乳清析出过多。