活性污泥中微生物分离纯化与培养 中国环境管理干部学院 环境技术研究与实验中心 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

一、实验目的 二、实验器材及设备 1、掌握从环境(水体或活性污泥)中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。 2、掌握几种接种技术。 二、实验器材及设备 1、无菌培养皿(直径90毫米)、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌试管、5管无菌水(每管有9毫升灭菌过的自来水)。 2、营养琼脂培养基(已灭菌的)、活性污泥。 3、接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)、超净工作台等。 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

三、细菌纯种分离的操作方法 细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法 （一）稀释平板分离法 1、取样 从活性污泥法曝气池中取活性污泥若干，于无菌烧杯中(取用有代表性的样品)。 2、稀释水样 将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10毫升的无菌移液管吸取10毫升水样置于第一瓶90毫升无菌水(内含玻璃珠)中，持移液管吹洗三次，用手摇10分钟将颗粒状样品打散。即为10-1浓度的菌液。用l毫升无菌移液管吸取l毫升10-1浓度的菌液于一管9毫升无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-6。稀释过程如图 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

样品稀释过程 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。倒置于30℃培养24～48h后观察结果。 3、平板的制作 取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。取1支1mL无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勾)加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。倒置于30℃培养24～48h后观察结果。 倒平板 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。 2、操作 (二)平板划线分离法 1、平板的制作 将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。 2、操作 用接种环挑取一环活性污泥(或土壤悬液等)，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内．在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)，划线的方式可取下图中任何一种。划线完毕盖好皿盖，倒置．30℃培养24～48h后观察结果。 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

四、接种技术操作 由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术 、液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种 、穿刺接种、稀释平板涂布法等 本实验中只对稀释平板涂布法进行简单介绍 稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在0.5ml以下，培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

1)稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 2)倒平板：将融化的并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板。 实验步骤如下： 1)稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 2)倒平板：将融化的并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板。 3)用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，换上无菌玻璃刮铲在平板上旋转涂布均匀。 4)正摆在所需温度的恒温箱内培养，如果培养时间较长，次日把培养倒置继续培养。 5)待长出菌落观察结果。 Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment

用一根无菌移液管接种几种浓度的水祥时，应从哪个浓度开始？为什么? 五、思考题 用一根无菌移液管接种几种浓度的水祥时，应从哪个浓度开始？为什么? Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment