基因工程复习

以通过基因工程用大肠杆菌制造人胰岛素为例 基因工程基本过程: 以通过基因工程用大肠杆菌制造人胰岛素为例 (1)获取目的基因(这里指人胰岛素基因) (2)目的基因与运载体重组(常用的运载体是质粒) 限制酶与DNA连接酶的作用特点 限制酶切割的DNA片段如何分离？ 凝胶电泳法 (3)重组DNA导入受体细胞(大肠杆菌细胞) (4)筛选含目的基因的受体细胞 利用标记基因的初步筛选 进一步筛选能合成人的胰岛素的工程菌

识别DNA分子中特定的脱氧核苷酸序列，并切断特定部位两个相邻脱氧核苷酸之间的化学键（有很强的专一性） 基因工程中两种重要的酶 作用特点 作用部位 限制酶 DNA连接酶 识别DNA分子中特定的脱氧核苷酸序列，并切断特定部位两个相邻脱氧核苷酸之间的化学键（有很强的专一性） 多核苷酸链上连接两个相邻脱氧核苷酸的化学键（磷酸二酯键） 通过形成磷酸二 酯键将DNA片段“粘连”起来 同上 利用这两种酶怎样形成重组DNA？

限制酶识别切割的序列是典型的旋转对称型回文结构 由限制性核酸内切酶切割 限制酶识别切割的序列是典型的旋转对称型回文结构 识别GAATTC的限制酶 粘性末端

由限制性核酸内切酶切割出平末端 识别AATT的限制酶 平末端

+ 还可能有哪些产物？ 重组质粒(重组DNA) 目的基因自连 切开的质粒自连 质粒 用相同的限制酶 用识别GAATTC的限制酶切割 目的基因

解旋酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶作用部位分别在哪里？ 磷酸二酯键

1.右图为DNA分子片段结构示意图，下列描述正确的是 （可以多选） A．DNA聚合酶的作用部位是⑾ B．解旋酶作用的部位是⑨ 真题演练 1.右图为DNA分子片段结构示意图，下列描述正确的是 （可以多选） A．DNA聚合酶的作用部位是⑾ B．解旋酶作用的部位是⑨ C．某限制性核酸内切酶可选择⑨处作为切点 D．DNA连接酶可连接⑩处断裂的化学键 B、D ⑾

4种色素随层析液在滤纸条上扩散的速度不同，所以被分离开来 知识回顾 凝胶电泳法分离DNA片段 1kb=1000碱基对 A B C 单位（kb） 4种色素随层析液在滤纸条上扩散的速度不同，所以被分离开来 DNA片段的大小不同，在凝胶上的迁移速率不同，所以不同大小的DNA片段可通过凝胶电泳分离开来

注意：切割后，在表示DNA片段的长度是多少个碱基对时，不考虑形成粘性末端所破坏的4-8对碱基。 有一种长度为6.5kb（千碱基对）的质粒，分别用限制酶E、限制酶B和限制酶H以不同的组合方式切割，并电泳分离，结果如下图所示，其中酶E特异性识别 GGCC DNA片段长度 E B +E H+ E 5.0kb 3.0kb 1.5kb 2.0kb 1.0kb 0.5kb E B +E H+ E 限制酶E、限制酶B和限制酶H在这个质粒上分别有几个切割位点？ 5.0 5.0 3.0 DNA片段长度(kb) 2.0 酶E 2个切点，酶B 1个切点, 酶H 1个切点 1.5 1.5 1.0 0.5 注意：切割后，在表示DNA片段的长度是多少个碱基对时，不考虑形成粘性末端所破坏的4-8对碱基。

09年37. 人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。 真题演练 09年37. 人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。 （3）已知限制酶E识别序列为CCGG,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见下图），那么正常人的会被切成________个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的 种片段。 3 460 220 2

抗生素抗性基因 标记基因 能产生某种荧光、颜色等的基因

下图表示基因工程的部分过程，作为受体细胞的大肠杆菌细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。导入步骤完成后，如何利用标记基因来初步筛选呢？ 胰岛素基因 受体大肠杆菌 导入 卡那霉素抗性基因 利用抗生素抗性基因初步筛选 四环素抗性基因 质粒A 3 2 1 4 5 能在此培养基上生长的是含 有 的大肠杆菌 重组 质粒或自连质粒 四环素 含有 培养基

平板影印培养法（印章法） 不同培养基 相同培养基 包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章

平板影印培养法（印章法） 大肠杆菌 导入 4 1 4′ 1′ 2 5 2′ 3 含有 培养基 含有 培养基 胰岛素基因 卡那霉素抗性基因 利用抗生素抗性基因初步筛选 四环素抗性基因 质粒A 3 2 1 4 5 2′ 1′ 4′ 印章法 四环素 含有 培养基 含有 培养基 卡那霉素

下图表示基因工程的部分过程，作为受体细胞的大肠杆菌细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。含有lacZ显色基因的大肠杆菌菌落在特定的X培养基上成蓝色，普通大肠杆菌菌落为白色。导入完成后，如何筛选呢？ 胰岛素基因 大肠杆菌 导入 lacZ显色基因 利用标记基因初步筛选 四环素抗性基因 质粒A 能在此培养基上生长的是含 有 的大肠杆菌 重组 质粒和自连质粒 蓝 含自连质粒大肠杆菌菌落显示 色 含重组质粒大肠杆菌菌落显示 色 白 含有四环素的X培养基

进一步筛选 将经过初步筛选含有重组质粒的大肠杆菌培养，形成单个菌落，再检测其是否含有目的基因的表达产物——人的胰岛素，有胰岛素的即为基因工程改造成功的工程菌。 无胰岛素 有胰岛素 淘汰无胰岛素的菌落、保留有胰岛素的菌落、进一步培养和繁殖,通过细菌发酵可生产大量人的胰岛素。

DNA连接酶作用位置 DNA连接酶作用位置