实验二 细菌的生理学 第二周

实验内容 基础培养基的制备 细菌的接种技术和培养方法 细菌代谢产物的测定 细菌生长情况的观察

目的要求 了解培养基的概念、基本成份、制备过程、种类及用途。 掌握细菌的纯种分离培养技术和不同种类培养基接种法。 了解常用细菌培养法及培养结果的观察与描述方法。 掌握细菌常见的生化反应的原理、操作方法及结果观察法。

一、基础培养基的制备（示教） 1.培养基的概念：培养基是用人工方法，将多种物质按照各类微生物生长繁殖所需要而配制的一种混合营养料。

2.培养基 的制备过程 冰箱备用 调pH 以牛肉膏汤培养基为例（液体） 成分： 过滤 牛肉膏3克 分装 蛋白胨10克 加热融化 氯化钠5克 蒸馏水1000毫升 过滤 分装 加热融化 高压灭菌 调配 无菌检测 冰箱备用

肉汤培养基 取1000毫升肉浸液，加入10克蛋白胨和5克氯化钠 经上述步骤制成。 其营养价值较牛肉膏汤要高。 但因肉浸液制作烦琐，而牛肉膏汤培养基制作简单，故常用。

肉汤琼脂固体、半固体培养基 琼脂：属于凝固剂，其化学成份主要是酸性多糖。其特点是当温度达到98℃以上可融化于水，45℃以下则凝固。 肉汤琼脂半固体培养基：取100毫升pH7.8的肉汤或牛肉膏汤培养基加入加入0.3～0.5％琼脂制成。 肉汤琼脂固体培养基：取100毫升pH7.8的肉汤或牛肉膏汤培养基加入2～3克的琼脂制成。

3.培养基的种类 按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。 按照培养基的用途可分为五类。 按照培养基的组成成分分为三类。

各种培养基 固体基 斜面 半固体

选择培养基 厌氧培养基 鉴别培养基 增菌培养基 基础培养基

4.培养基的用途 传染病病原的诊断和鉴定 细菌学研究 生物制品的制备 菌种的保存 制造各种产品 基因工程中的应用

二、细菌的分离培养技术 大多数细菌都可用人工的方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究各种生物学特性。培养细菌时，根据研究的目的和细菌生长的需要，要采用不同的接种技术和培养方法。 接种技术一般分为分离培养法和纯种细菌接种法

（一）分离培养法 细菌分离培养的目的是获得纯种（单个菌落）。 分离培养成纯种菌的方法有平板划线法、倾注平板法和动物接种分离法等，其中以划线法最为常用。

1．平行划线法： 标记 涂基线 划线 划线完毕，将琼脂平板培养基复盖皿盖，并在培养皿底玻璃上，用笔蜡注明接种菌名、接种者姓名及班级、日期等，将培养皿倒置放在孵育箱培养，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下。

平行划线法的示意图 见图2-2A B是最常使用的、最基本的方法，其中图B常用于含菌量较少的标本。

2．分区划线法： 基本步骤与平行划线法相同，不同之处是在每次划线前要烧灼接种环，以杀灭环上留剩的菌液。 如图2-3C、D和图2-4E所示，用于含菌量较多的标本。 本次试验要求同学首先掌握细菌分离培养的平行划线法。

图2-3 分区划线法示意图   三段分区法 四段分区法

五段分区法 孵育后情况

【实验结果观察记录】 细菌生长情况的观察 观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形 状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

菌落（R型） 细菌的群体形态 单菌落（clone) 菌苔(lawn)

1、细菌菌落的特征 一般都较小，菌落与培养基结合不紧密，用接种针容易挑起，多数表面较光滑、湿润、较粘稠，易挑取，质地均匀，色泽多样。 Bacterial colonies

细菌菌落特征：常见的平面正面图

细菌菌落特征：剖面图

2、菌落的三个类型： 1.光滑型菌落（Smooth type Colony） ：又称S型 2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型 3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型

菌落（S型） culture plate ◆菌苔：——众多菌细胞在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体。其作用:可用来保存菌种等。 ★细菌在固体或液体培养基中经生长繁殖所形成的细胞群体常构成某种特定的形态结构，它们常是菌种分离及鉴定的依据。 ★平板培养和斜面培养——是实验室中用固体培养培养微生物的两种最常用的培养方式。 ◆菌落：———单个或少量菌细胞在固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群落。 ◆菌苔：——众多菌细胞在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体。其作用:可用来保存菌种等。 ◆液体培养可用试管、三角瓶、发酵罐等器皿，液体培养时的群体形态有菌球、菌膜、絮状等。 ★(二) 细菌群体的形态 菌落的定义：将单个细胞或一小堆同种细胞接种在固体培养基表面（有时是内部），当它占有一定的发展空间并给予适宜的培养条件时，该细胞就迅速生长繁殖，结果回形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见的，有一定形态构造的子细胞群体，这就是菌落（colony）。如果菌落是由一个单细胞发展而来的，则它就是一个纯种细胞群或克隆（clone）。 菌苔的概念：如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的菌落相互联接成一片，这就是菌苔（lawn）。 菌落特征与菌种鉴定：菌落的特征包括湿润或干燥、光滑或粗糙、透明度、粘稠度、质地、正反面或边缘与中间颜色一致与否等。由于细菌属于单细胞生物，细胞间没有分化，细胞较小，所以细菌菌落含水量高，并具有其共同的特征；由于不同细菌在细胞大小、形态、表面结构等方面的差异，它们所形成的菌落就各具特点。菌落形态在细菌的鉴定中有一定的参考价值，对细菌的分离纯化、计数以及选种、育种等工作中都有具体的应用。 幻灯片092.093.094.095.096.097 细菌在明胶穿刺接种中生长且水解明胶的情况不同，这也可以作为菌种鉴定的依据。 culture plate

菌落(R型)

3、影响菌落形态的因素 各种微生物在一定条件下形成的菌落，其形态特征有一定的稳定性和专一性，因而可以作为识别、鉴定菌种的一个依据，但也受某些因素的影响，观察时应加以注意。 1、邻近菌落 2、培养时间 3、培养基成分 4、培养温度

（二）细菌纯种接种法 1.斜面培养基接种法 2.液体培养基接种法 3.半固体培养基穿刺接种法

取菌的方法

斜面接种法及接种后菌落生长示意图

接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)

液体培养基接种法半/固体琼脂培养基种接法

液体培养时的群体形态：

穿刺培养的生长特征

（三）细菌的培养方法 一般培养法 二氧化碳培养法 厌氧培养法

三、细菌常见的生化反应结果观察 （一）单糖发酵试验 【材料】 1．菌种：大肠杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌斜面培养物。 2．培养基：葡萄糖、乳糖半固体发酵管。 【方法】 半固体穿刺接种法

【结果观察】 在半固体发酵管中，如细菌分解这种糖，则指示剂改变颜色，如还能产气，则培养基中有气泡形成。 产酸者用“+”表示， 产酸又产气用“⊕”表示， 不分解者用“－”表示。

（二）IMViC试验 【材料】 菌种：大肠杆菌、产气杆菌的18～24小时斜面培养物。 培养基： 蛋白胨水培养基。 葡萄糖、磷酸盐蛋白胨水培养基。 枸橼酸盐利用试验

1.吲哚（靛基质）试验 原理：测细菌有无色氨酸酶 方法：分别接种大肠杆菌，产气杆菌于2支蛋白胨水培养基中。37℃孵育48小时后取出，每管加2～3滴吲哚试剂于液面上，在接触面呈玫瑰红色（环状）者为阳性，仍呈黄色者为阴性。

2.甲基红试验 原理：测定细菌分解葡萄糖后，培养物中的最后酸碱度。 方法：分别接种大肠杆菌和产气杆菌于2支葡萄糖磷酸盐蛋白胨水培养基中。37℃孵育2～3天后取出，分别滴加甲基红试剂2～3滴，可立即观察，阳性者呈红色，阴性者呈桔黄色。

3.Voges-Proskauer二氏试验 （简称V—P试验） 原理：某些细菌能分解葡萄糖，并使产生丙酮酸发生脱羧反应。 方法：分别接种大肠杆菌和产气杆菌于2支2毫升葡萄糖磷酸盐蛋白胨水培养基中，孵育后分别加入1毫升KOH和α一萘酚溶液摇匀，震荡10分钟，出现红色者，为阳性反应。

4.枸橼酸盐利用试验 原理：测定细菌能否利用枸橼酸盐作为碳的唯一来源。 方法：分别接种大肠杆菌，产气杆菌于2支枸橼酸盐培养基上。孵育后观察，有菌苔出现，培养基颜色变为深蓝色，构橼酸盐利用试验阳性；细菌不生长，培养基颜色不变者，为枸橼酸盐利用试验阴性。

（三）硫化氢产生试验 原理：测定细菌能否分解培养基中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）。 方法：以穿刺接种法将大肠杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌接种于3支醋酸铅培养基内。37℃孵育24小时后观察，穿刺部位呈黑褐色者为阳性，不变颜色者为阴性。

要求： 分组记录上述实验的生化反应结果，并写出实验报告。 记录普通琼脂平板上的菌落特征。