项目人员：程玉娇 刘 贺 何晓叶 张 莉 指导老师：李应彪 许程剑 2011年11月 SRP项目申请答辩 乳酸菌对低温肉制品作用的研究 项目人员：程玉娇 刘 贺 何晓叶 张 莉 指导老师：李应彪 许程剑 2011年11月 SRP项目申请答辩

内容提要 一、项目的研究背景 二、研究的意义 三、国内外研究现状 四、研究目标 五、实验内容 六、预期成果 七、项目进度安排

一.项目的研究背景 低温肉制品是近几年来在肉制品加工中依据加热杀菌温度进行分类而得名的，是指采用较低的杀菌温度进行巴氏杀菌，即将肉制品中心温度达到72~85℃保30min而生产的，其成品需要在( 0~4℃) 条件下进行的冷链运输、贮藏和销售的一类产品。 具有如下的特点：肉经过低温巴氏杀菌，蛋白质适度变性从而获得较高的消化率，为人体提供较高的有效的营养成分；肉质结实、富有弹性、有咀嚼感，且鲜嫩、脆软、多汁，最大限度地保持了原有营养和固有的风味。

一.项目的研究背景 由于传统的低温肉制品生产灭菌不彻底，残存一定量的微生物, 且低温肉制品又是营养丰富的中性食品，因而，产品在后期存放过程中微生物很容易大量的生长繁殖而导致其腐败变质，使其货架期短。

1、采用安全高效的贮藏保鲜方法,延长其货架期是今后低温肉制品研究的主要内容和方向。 二、研究的意义 1、采用安全高效的贮藏保鲜方法,延长其货架期是今后低温肉制品研究的主要内容和方向。 2、从我国具体实际出发，开发安全高效的低温肉制品综合保鲜技术已成为目前学术界研究的热点，也是目前产业界及待解决的技术攻关问题。该方向的技术投入和研发具有重大的现实意义。

三、国内外研究现状 1、国外在上世纪80年代已开始研究低温肉制品天然保鲜剂，菌类作为一种天然高效的新型食品防腐剂已被许多国家广泛应用于多种食品的防腐保鲜。 2、在我国，这方面的研究较晚，虽然取得了一些进展，但作为世界第一大肉类生产国，我国的肉制品行业仍具有巨大的发展空间。而低温肉制品由于最大限度地保留了原料肉的风味物质和营养成分，因此更加营养、健康、美味，也是未来中国肉制品发展的主要方向。

1、研究低温肉制品贮藏过程中的微生物变化。 四、研究目标 1、研究低温肉制品贮藏过程中的微生物变化。 2、分离鉴定引起低温肉制品腐败的优势微生物。 3、研究乳酸菌对腐败微生物抑菌效果，筛选对腐败微生物广谱抑菌效果的菌株。

五、研究内容 （一）低温肉制品中微生物的培养 （二）主要腐败微生物的分离纯化 （三）将分离得到的微生物进行菌落分析和性质鉴定。 （四）腐败菌DNA的提取

五、研究内容 样品处理→培养基的配制→菌体的富集→等浓度梯度稀释涂布、培养→固体培养基上分离、纯化→菌株的保藏→生理生化指标的鉴定→DNA的提取→菌种保留→分子生物学鉴定→确定菌种与肉制品的对应相关性

（一）低温肉制品中微生物的培养 将牦牛肉保存在0～4℃冰箱里，将取出20g牦牛肉剪碎，浸泡在有200ml的已灭菌的生理盐水的锥形瓶中，将锥形瓶放于摇床上进行振摇3h，从瓶中分别取出1ml液体于液体培养基MRS和PCA中，37℃富集24h。

（二）主要腐败微生物的分离纯化 将富集的菌种稀释浓度梯度设置10-1至10-7，分别进行涂布，培养48h，随机挑取单个菌落，以划线方式在PCR和MRS培养皿上进行分离纯化。 附：PCR和MRS培养皿图片（P代表PCA，M代表MRS）

M 10-2 P 10-2

M P

M P

（三）将分离得到的微生物进行菌落分析和性质鉴定 1、菌落分析 （1）固体培养特征 将活化好的菌株接种于新鲜MRS和PCA平板，28℃培养,观察并记录： a 、菌落质地：是否奶酪状，是否粘稠，易挑不易挑，是否湿润 b、菌落颜色：乳白色或奶油色，注意是否有颜色变化，红色，橙色，黄色及玫红等中间色；

c、菌落表面特征：透明不透明，光滑或粗糙，褶皱或突起等； d、菌落边缘：全缘是否光滑规整，波浪状，裂叶状，蚀刻状，根或须状等； e、菌落高度：隆起或扁平，高低凸面

（2）显微特征 a、细胞形态特征：球形、卵球形、柱状、棒状、杆状、长杆状等 b、细胞单生、对生或群生

（3）形态图比较 类别 菌落图片 菌落形态 细胞图片 细胞形态 M1 M2 M3 M4 M5 P1 P2 P3 P4 P5 P6 菌落粉红色，表面较透明，边缘光滑整齐，有粘性 卵圆形、较大较厚、出芽生殖 M2 菌落较大略显白色，边缘有隆起 大部分圆形，较小 M3 菌落较小，白色，边缘光滑无隆起 大部分为圆形，两个或两个以上成串珠状 M4 主要为较小的单菌落，微白色，无隆起 大部分为圆形，形态较小 M5 菌落较小，白色，边缘有较小隆起 大部分为圆形，部分成串珠状 P1 菌落较小，白色，边缘有小隆起 短杆状 P2 多数为较小的单菌落，较小的隆起 杆状，部分有出芽生殖 P3 菌落较大，微白色，边缘光滑，无隆起 P4 菌落为片状，表面干燥有褶皱，白色 大部分为长杆状，有芽孢产生 P5 菌落较湿润，易被接种环挑起，白色 P6 菌落较大，表面干燥有褶皱，边缘隆起不规则 杆状 （3）形态图比较

（4）用固体斜面对菌株进行保藏：在无菌间操 作台用接种环挑取已经分离纯化的菌株单个菌落在制备好的试管固体斜面上画“Z”字，近酒精灯外焰塞好棉塞，做好标记，置于0℃-4℃冰箱保藏。

2、性质鉴定 （1）糖或醇发酵试验 a、配制葡萄糖蛋白胨培养基时，将蛋白胨先加热溶解，调到pH之后，加入溴甲酚紫溶液（1.6%水溶液），待呈紫色，再加入葡萄糖，使之溶解，分装试管，最后将杜氏小管倒置放入试管中。

（1）糖或醇发酵试验 b.分别将M和P性11种菌接种于糖发酵培养基，置于37℃恒温箱中，培养24小时。另外保留一支不接种的培养基，作为空白对照。 c.观察并记录实验结果。产酸又产气用“⊕”表示，只产酸不产气用“+”表示，不产酸不产气用“—”表示。

b、观察结果时，沿管壁加入M.R.试剂3～4滴，培养基变红色者为阳性用“+”表示，变黄色者为阴性用“-”表示。 a、分别将M和P性11种菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，置37℃恒温箱中，培养24h。 b、观察结果时，沿管壁加入M.R.试剂3～4滴，培养基变红色者为阳性用“+”表示，变黄色者为阴性用“-”表示。

（2）甲基红（M.R.)试验

（3）乙酰甲基甲醇（V.P)试验 a、分别将M和P性11种菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，置于37℃恒温箱，培养24h。 b、观察并记录实验结果，在培养液中加入40%KOH溶液10～20滴，再加入等量的a-萘酚溶液，拔去棉塞，用力振荡，再放入37℃温箱中保15～30min（或在沸水浴中加热1～2min）。如培养也出现红色为V.P.阳性反应用“+”表示，否则用“-”表示。

（3）乙酰甲基甲醇（V.P)试验

（4）过氧化氢酶试验 1.将实验菌接种于合适的培养基斜面上，室温培养18～24h。 2.观察并记录实验结果，取一块干净的载玻片，在上面滴1滴3%～10%H2O2溶液，挑去一环培养好的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若产生气泡，为过氧化氢酶阳性反应，用“+”表示，不产生气泡者为阴性反应，用“-”表示。

a、取11支柠檬酸铁铵半固体培养基，分别穿刺接种实验菌，置于37℃恒温箱培养24h。 （5）硫化氢产生试验 a、取11支柠檬酸铁铵半固体培养基，分别穿刺接种实验菌，置于37℃恒温箱培养24h。 b、观察结果，如培养基中出现黑色沉淀者为阳性反应。同时观察接种线周围有无向外扩展情况，如有表示该菌具有运动能力。阳性反应用“+”表示，无黑色沉淀为阴性反应，用“-” 表示。

（6）硝酸盐还原试验 a、将使用菌接种于硝酸盐还原培养基中，置于37℃恒温箱中培养48h。另取一支不接种的硝酸盐培养基作为对照。 b、观察结果 把对照管分成两管，在其中的一管中加入少量锌粉，加热，再加入格里斯氏试剂（亚硝酸盐试剂），如出现粉红色，说明培养基中存在硝酸盐。

（6）硝酸盐还原试验 c、把接过种的培养液也分成两管，其中一管加入格里斯氏试剂，如出现红色，则为阳性反应，用”+“表示。如不出现红色，则在另一管中加入少量的锌粉，并加热，再加入亚硝酸试剂，如出现红色，则证明硝酸盐仍存在，此为阴性反应，用“—”表示，如不出现红色，则说明硝酸盐已被还原，应为阳性反应。

（7）革兰氏染色 a、涂片 加一滴蒸馏水于载玻片上，再用接种环挑取少量的菌与载玻片上的水滴混合均匀，并途程薄薄的菌膜。 b、固定 即涂片在空气中干燥：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过3次，冷却。 c、初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸按结晶紫染色液，染色1～2min，倾去染色液，用自来水小心地冲洗。

（7）革兰氏染色 d、媒染 滴加哥路氏碘液，染1～2min，水洗 脱色后滴加95%乙醇，脱色20～25s，立即水洗，已终止脱色。 e、复染 滴加番红，染色2～3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。

A1 A2

(8)生理生化鉴定结果 M1 + - M2 ⊕ G- M3 M4 M5 P1 P2 P3 P4 P5 P6 空白 类别 糖或醇发酵试验 M.R试验 V.P.试验 H2O2酶 试验 H2S试验 硝酸盐还原试验 革兰氏染色 M1 + - G+ M2 ⊕ G- M3 M4 M5 P1 P2 P3 P4 P5 P6 空白

（四）腐败菌DNA的提取 a、方法：试剂盒提取DNA。 b、目的：DNA 的提取分析，是以核酸一级结构为依据的微生物分类、鉴定方法。

提取DNA的目的意义 c、意义：操作简便，可有效地避免实验数据丢失； 通过基因水平探索菌群落的丰度、均匀度,分析优势菌群的动态变化情况等； 将菌种多样性的研究建立在分子遗传学水平上； 为全面认识菌种多样性及其在生态系统中的功能，筛选出未知的优质菌种提供了行之有效的技术手段。

六、预期成果 （1）提供一套技术资料； （2）提供具有明显抑菌效果的乳酸菌菌株1-2株；

1、分子生物学鉴定，对前期提取DNA的菌株进行16SrDNA序列PCR 扩增，并测序; 六、后期实验计划 1、分子生物学鉴定，对前期提取DNA的菌株进行16SrDNA序列PCR 扩增，并测序; 2、确定菌种与肉制品的对应相关性。

1.分子生物学鉴定 a、PCR技术是一种用在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。在酵母菌的分子生物学鉴定中常常用到的16SrDNA PCR-TGGE技术。 b、基本原理：依赖于与靶细胞序列两端互补的寡核苷酸引物，由变性--退火--延伸 三个基本反应步骤。

1.分子生物学鉴定 c、扩增反应体包括：缓冲液，Mg离子，dNTPs，正向反向引物，Tag酶，模板DNA，去离子水。用到的仪器有离心机，PCR仪，电泳槽，微波炉，凝胶成像仪。

1.分子生物学鉴定 d、PCR扩增后的DNA通过测序仪进行序列。将测定的序列提交NCBI。获得GeneBank数据库中的临时登录号，通过Blast软件与GeneBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较，选取同源性接近的基因序列，应用邻接法构建系统发育树。

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