植物组织培养实验 农林科技学院 主讲：张庆霞

目录 实验一 MS固体培养基的制备及灭菌 实验二 外植体的灭菌及初代培养物的建立 实验三 无菌材料的继代培养 实验四 组培苗的驯化与移栽

实验一 MS固体培养基的制备及灭菌 一、 实验目的 巩固培养基相关理论基础知识，掌握培养基制备方法及灭菌技术

二、材料、试剂与用具 配制MS培养基母液所需要的药品、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、95%的酒精或0.1mol/L的NaOH、0.1mol/LHCl。 各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱。

三、方法步骤 1、母液的配制 （1）母液1的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 NH4NO3 8.25g， KNO3 9.5g，MgSO4H2O 1.85g 混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合。 定容：加蒸馏水定容至1000ml成50倍液。

（2）母液2的配制 称量：用电子天平称取CaCl2.2H2O22.0g。 定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液 （3）母液3的配制 称量：用电子天平称取KH2PO48.5g 定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。

（4）母液4的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 Na2-EDTA 1. 85g FeSO4. 7H2O 1 （4）母液4的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 Na2-EDTA 1.85g FeSO4.7H2O 1.39g 混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解后混合。 定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。

（5）母液5的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 H3BO3 0. 31g，NaMoO4·2H2O 0 （5）母液5的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 H3BO3 0.31g，NaMoO4·2H2O 0.0125g， MnSO4·4H2O 1.115g， CuSO4·5H2O 0.00125g， ZnSO4·7H2O 0.43g CoCl2·6H2O 0.00125g KI 0.0415g 混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合。 定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。

（6）母液6的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 肌醇 5. 0 g VB6 0. 025g 甘氨酸 0. 1g VB1 0 （6）母液6的配制 称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。 肌醇 5.0 g VB6 0.025g 甘氨酸 0.1g VB1 0.005g 烟酸 0.025g 混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解后混合。 定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。

（7）植物生长调节物质母液的配制 称量：用电子天平称取生长素或细胞分裂素50-100mg。 溶解：生长素用少量95%的酒精或0 （7）植物生长调节物质母液的配制 称量：用电子天平称取生长素或细胞分裂素50-100mg。 溶解：生长素用少量95%的酒精或0.1mol/L的NaOH溶解，细胞分裂素用0.1mol/LHCl加热溶解。 定容：加蒸馏水定容至100ml配制成0.5-1mg/L的溶液。 (8) 装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培养基名称、母液倍数与配制日期。

2、 MS固体培养基的配制、分装和灭菌 称取一定量的琼脂和蔗糖，加入蒸馏水（目标体积的2/3左右）电磁炉上加热；取出母液按顺序放好，量取适量的各母液（根据情况事先在烧杯中加200-500ml蒸馏水），待琼脂蔗糖完全溶解后加入，继续加热至沸腾；定容至目标体积；调整pH值到5.8；分装到培养瓶中，封口；121℃高温高压灭菌20分钟；取出放到洁净的房间凝固后备用。

四、实验报告 将本次实验内容整理成实验报告并探讨培养基配制过程需要注意哪些问题。

实验二 外植体的灭菌及初代培养物的建立 一、 实验目的 通过外植体灭菌处理、超净工作台上外植体接种等无菌操作训练，掌握植物组织培养材料灭菌的基本方法及无菌操作技术，建立无菌培养体系。

二、材料、试剂与用具 1、材料：植物的茎、叶、种子等。 2、仪器：超净工作台、显微镜、解剖刀、刮皮刀、不锈钢打孔器、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等。 3、试剂：培养基（MS+10mg/L2，4-D+2mg/L6-BA）、70%乙醇、饱和漂白粉溶液。

三、实验步骤 1、材料的选择 选用健壮、无病虫害的枝条、晴天近中午取材。 2、材料的灭菌 选取长约10厘米的苹果嫩枝条于饱和漂白粉溶液或 0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，然后用无菌水冲洗3次。

3、无菌接种操作 用剪刀将灭菌后的枝条剪成1-1.5厘米长的小段，接种于培养基上，形态学下端在下。 4、培养条件的设置 培养物置于25℃左右的培养室中，每天光照12小时，光照度为850-1200lx。

四、实验报告 将本次实验内容整理成实验报告并探讨外植体灭菌不彻底的可能原因有哪些。

实验三 无菌材料的继代培养 一、 实验目的 进一步熟悉无菌操作的过程，为后续实验培养植物材料。

二、材料、试剂与用具 1、材料：植物组培苗。 2、仪器：超净工作台、长手术剪、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿等。 3、试剂：培养基（MS+0.2mg/LIBA+0.5mg/L6-BA）、70%乙醇。

三、方法步骤 1、接种人卫生处理及准备 洗净双手，剪掉长指甲，更衣，戴帽和口罩，换拖鞋。 2、超净工作台操作及接种准备 预先打开紫外灯照射20min,同时打开风机，空白培养瓶放入超净工作台。接种用具齐全。接种前关闭紫外灯，打开日光灯。

3、手及工作台面消毒 自瓶中倒出酒精棉球，先手心后手背手指尖擦试，然后用酒精棉球擦试接种活动区域。 4、接种器材消毒灭菌操作 点燃酒精灯。然后自灭菌过的塑料袋中取出接种工具及培养皿，分别用酒精棉球按先后顺序擦试培养皿和接种工具，而后灼烧灭菌。接种工具灼烧后置于距胸前的培养皿上。

5、转接 （1）打开原种瓶，随即瓶口灭菌，并置于酒精灯左侧的有效接种区域内。 （2）使用镊子剪刀配合自原种瓶中取出部分种苗，直接切割或置于培养皿后再切割。反复切割成多个茎段，其长为0.5-1cm。工具灼烧后重新置于培养皿上冷却。

（3）打开空白培养瓶并瓶口过火，左手持瓶横向置于接种有效区域内，右手持镊子夹住茎段逐个移接入空白培养瓶内。每瓶接3个外植体。每瓶接完，镊子置于培养皿，随即瓶口过火扎口。随即镊子过火后置于培养皿，打开另1空白培养瓶，重复操作，反复移接。移接量28瓶/h以上 。 （4）转接结束后，收拾工作台面。

四、实验报告 培养3天后观察，开始统计污染率。20天后统计增殖情况并计算增殖系数。

实验四 组培苗的驯化与移栽 一、实验目的 　要求学会和掌握组培苗的驯化和移栽方法。

二、材料、试剂与用具 1、材料：生根的植物组培苗。 2、试剂与用具：蛭石、珍珠岩、腐殖土，草炭土、砂子、喷壶、育苗盘、塑料钵等。

1、移栽基质的配制：用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。 三、方法步骤 1、移栽基质的配制：用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。 2、移栽前的练苗:移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

3、移栽和幼苗的管理 从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90％以上。

四、实验报告 将本次实验整理成实验报告并探讨提高组培苗移栽成活率的措施有哪些。

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