氨基酸的薄层层析 氨基酸的薄层层析

一、目的与要求 熟悉用层析技术分离不同物质的原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 本次实验的目的与要求：熟悉用层析技术分离不同物质的原理。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

层析技术 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各 组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)的差异，在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及 解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分 离。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯 化某种物质，其纯度高达99%。层析法的特点是分离率、灵敏度(pg-fg 级)、选择性均高的一种分离方法。尤其适合样品含量少，而杂质含量 多的复杂生物样品的分析。 无论哪种层析均由固定相和流动相组成。固定相可以是固体也可以是液 体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体 (Support)。同样流动相可以是液体也可以是气体。 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异，在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99%。层析法的特点是分离率、灵敏度(pg-fg级)、选择性均高的一种分离方法。尤其适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。 无论哪种层析均由固定相和流动相组成。固定相可以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相可以是液体也可以是气体

层析技术的分类 按层析原理分类 1. 吸附层析(Absorption Chromatography) 固定相是固体吸附剂，利用各组 分在吸附剂表面吸附能力的差别而进行分离。 2. 分配层析(Partition Chromatography) 固定相为液体，利用各组分在两液 相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 3. 离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography) 固定相为离子交换剂，利 用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 4. 凝胶层析(Gel Chromatography) 固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上 受阻滞的程度不同而进行分离。 5. 亲和层析(Affinity Chromatography) 根据生物特异性吸附进行分离，固定 相只和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力而结合，而与无结合能力的其 他组分分离。 按层析原理分类 1. 吸附层析：固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进行分离。 2. 分配层析：固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 3. 离子交换层析：固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 4. 凝胶层析：固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 5. 亲和层析：根据生物特异性吸附进行分离，固定相只和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力而结合，而与无结合能力的其他组分分离

按操作方式不同分类 1. 纸层析(Paper Chromatography) 以滤纸作为液体的载体， 点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 2. 薄层层析(Thin Layer Chromatography) 以一定颗粒度的 不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使 组分达到分离。 3. 柱层析(Column Chromatography) 将固定相装柱后，使样 品沿一个方向移动，以达到分离目的。 按操作方式不同分类 1. 纸层析：以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 2. 薄层层析：以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。 3. 柱层析：将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。

薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜 等作为固定相的载体，在板上涂上一薄层不溶性物 质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用 合适的溶剂作为流动相(展开剂)。 薄层层析因固定相涂布物质的不同，可分成吸附薄 层层析、离子交换薄层层析和分配薄层层析等3种。 通常说的薄层层析就是指吸附薄层层析。有关薄层 层析的基本原理与Rf值的计算与纸层析基本相似。 薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜等作为固定相的载体，在板上涂上一薄层不溶性物质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用合适的溶剂作为流动相(展开剂)。薄层层析因固定相涂布物质的不同，可分成吸附薄层层析、离子交换薄层层析和分配薄层层析等3种。通常说的薄层层析就是指吸附薄层层析。有关薄层层析的基本原理与Rf值的计算与纸层析基本相似。

现就薄层层析时应注意的事项简述如下： 一、吸附剂的选择 吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用 吸附剂有硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土、纤维素等。 硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质；氧 化铝和氧化镁是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性 物质；硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性 物质。 现就薄层层析时应注意的事项简述如下： 一、吸附剂的选择，吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用吸附剂有硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂，适合分离酸性和中性物质；氧化铝和氧化镁是微碱性吸附剂，适合分离碱性和中性物质；硅藻土和纤维素为中性吸附剂，适合分离中性物质。

二、吸附能力 一般用活度来表示吸附剂的吸附能力。吸附能力 主要受吸附剂含水量的影响。其由强到弱程度以I、II、 III、IV、V表示。吸附剂活度强时，能吸附极性较小的 基团；吸附剂活度弱时，对非极性基团吸附能力也较 强。一般利用加热烘干的办法，减少吸附剂的水分， 从而增强其活度。通常，分离水溶性物质时，因其本 身具有较强极性，故吸附剂活度要弱一些；相反，分 离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。 二、吸附能力，一般用活度来表示吸附剂的吸附能力。吸附能力主要受吸附剂含水量的影响。其由强到弱程度以I、II、III、IV、V表示。吸附剂活度强时，能吸附极性较小的基团；吸附剂活度弱时，对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的办法，减少吸附剂的水分，从而增强其活度。通常，分离水溶性物质时，因其本身具有较强极性，故吸附剂活度要弱一些；相反，分离脂溶性物质时，吸附剂活度要强一些。

三、颗粒大小 无论哪一种薄层层析，其吸附剂颗粒的大小和均匀性，是保证 每次实验保持Rf值恒定的基础，一般使用吸附剂颗粒直径为无 机类0.07~0.1mm (150~200目)，有机类0.1~0.2mm (70~140 目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差；而颗粒太 细，层析时展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。 薄层层析的优点是：设备简单，操作容易，层析展开时间短， 分离效率高，可用腐蚀性显色剂，并可在高温下显色。 纸层析和薄层层析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖类、脂类 和激素等物质的分离和鉴定。 三、颗粒大小，无论哪一种薄层层析，其吸附剂颗粒的大小和均匀性，是保证每次实验保持Rf值恒定的基础，一般使用吸附剂颗粒直径为无机类0.07~0.1毫米(150~200目)，有机类0.1~0.2毫米 (70~140目)。颗粒太粗，层析时溶剂推进快，但分离效果差；而颗粒太细，层析时展开太慢，易产生斑点不集中并有拖尾现象。薄层层析的优点是：设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，可用腐蚀性显色剂，并可在高温下显色。纸层析和薄层层析均可用于氨基酸、肽、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。

二、实验原理 薄层层析法（thin layer chromatography, TLC）是将吸附剂 （或称固相支持物,如硅胶G、硅藻土、氧化铝、氧化镁、纤 维素粉等）均匀地铺在玻璃板上使其成薄层。将待分析的样 品点加到薄层板的一端，然后把该端浸入适宜的展层剂（如 苯酚-水、正丁醇-冰醋酸-水等）在密闭的层析缸中展层。由 于各种氨基酸结构和性质的不同，其在吸附剂表面的吸附能 力各异，吸附力大的易被吸附剂吸附，而较难被展层剂所解 吸；吸附力小的则易被展层剂携带至较远的距离。这样，氨 基酸在吸附剂和展层剂之间反复多次的被吸附与解吸附，使 不同的氨基酸得以分离，并通过茚三酮反应显色作鉴别。 薄层层析法是将吸附剂（或称固相支持物,如硅胶G、硅藻土、氧化铝、氧化镁、纤维素粉等）均匀地铺在玻璃板上使其成薄层。将待分析的样品点加到薄层板的一端，然后把该端浸入适宜的展层剂（如苯酚-水、正丁醇-冰醋酸-水等）在密闭的层析缸中展层。由于各种氨基酸结构和性质的不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异，吸附力大的易被吸附剂吸附，而较难被展层剂所解吸；吸附力小的则易被展层剂携带至较远的距离。这样，氨基酸在吸附剂和展层剂之间反复多次的被吸附与解吸附，使不同的氨基酸得以分离，并通过茚三酮反应显色作鉴别。

三、操作步骤 薄层板的制备 调浆：称取硅胶G 4g，加0.2%羧甲基纤维素钠液10ml，置研 钵中充分研磨成均匀稀糊状。 干燥：将薄层板水平放置，室温下自然晾干。活化：晾干的薄 层板置干燥箱内60℃烘30min，然后升温至105℃活化30min， 切断电源后使（待）板面温度下降至不烫手时取出。 三、操作步骤。 1.薄层板的制备 调浆：称取硅胶G 4克，加百分之二的羧甲基纤维素钠液10毫升，置研钵中充分研磨成均匀稀糊状。涂布：取干燥洁净玻板1块置左手上，右手挑取3药勺硅胶G稀释液于玻板上均匀摊开，轻振玻板，使其均匀分布。干燥：将薄层板水平放置，室温下自然晾干。活化：晾干的薄层板置干燥箱内60度烘30分钟，然后升温至105度活化30分钟，切断电源后待板面温度下降至不烫手时取出。

薄层板 如图为制备好的薄层板

2. 点样：取内径约0. 5mm管口平整的毛细玻管3支，分别吸取谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸及混合氨基酸液，在距薄层板底端2 2.点样：取内径约0.5mm管口平整的毛细玻管3支，分别吸取谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸及混合氨基酸液，在距薄层板底端2.5cm处、间距1cm宽的位置上轻触点样，用电吹风（冷风）待点样处干后在原点样处重复点加1～2次 轻触疾起 点样：取内径约0.5毫米的管口平整的毛细玻管3支，分别吸取谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸及混合氨基酸液，在距薄层板底端2.5厘米处、间距1厘米宽的位置上轻触点样，用电吹风（冷风）待点样处干后在原点样处重复点加1～2次。 Glu Ala Phe Mix 2cm 1cm

3.展层 在层析缸中加入展层剂约1.5cm深，加盖平衡30min。将薄层板点样端浸入展层剂中，加盖密闭展层。当展层剂前沿到达薄层板的2/3高度时，取出薄层板，用铅笔描出溶剂前沿界线，在玻板背面划下展层剂前沿位置，用电吹风（热风）将薄层板吹干（最好对玻板背面吹）。 3.展层 在层析缸中加入展层剂约1.5厘米深，加盖平衡30分钟。将薄层板点样端浸入展层剂中，加盖密闭展层。当展层剂前沿到达薄层板的三分之二高度时，取出薄层板，用铅笔描出溶剂前沿界线，在玻板背面划下展层剂前沿位置，用电吹风（热风）将薄层板吹干（最好对玻板背面吹）。 Glu Ala Phe Mix

层析缸 如图为层析缸及展层

操作：用喉头喷雾器向薄层板上均匀喷洒0.5%茚三酮丙酮溶液，热风吹干至各层析斑点显现。 4. 显色 原理：氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。 操作：用喉头喷雾器向薄层板上均匀喷洒0.5%茚三酮丙酮溶液，热风吹干至各层析斑点显现。 4. 显色原理：氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。操作：用喉头喷雾器向薄层板上均匀喷洒百分之零点五的茚三酮丙酮溶液，热风吹干至各层析斑点显现。

四、结果计算 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

Rf = 斑点至原点距离 溶剂前缘至原点距离 小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的 Ｒｆ值。

数据处理 样品 Glu Ala Phe 混合液 斑点-原点 溶剂前缘-原点 Rf值 如下表做几种氨基酸及混合液的数据处理。

注意事项 1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多， 易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。 注意事项：1.切勿用手直接接触薄层板面。2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。

单选题 1. 固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附 能力的差别而进行分离的是（B） A. 分配层析 B. 吸附层析 C. 离子交换层析 D. 凝胶层析 2.按操作方式不同分类，层析技术不包含（C） A. 柱状层析 B. 纸层析 C. 亲和层析 D. 薄层层析 3.实验过程中出现斑点过大，互相交叉或拖尾的现象的原因是（B）。 A. 薄层制作的不均匀 B. 样品量太多 C. 样品量太少 D. 手接触薄层板

是非题 薄层层析的优点是设备简单，操作容易（）。 正确答案（对） 层析技术是利用混合物中各组分的理化性质的差异，在两相 运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程。（） 固定相均由固体成分组成。（） 正确答案（错）