基于超高分辨质谱的精准医学研究 李静 生命科学质谱应用经理 jing.li@thermofisher.com 18616512396

FDA approved cancer biomarkers 27 1 FDA approved cancer protein biomarkers Protein biomarkers discovered by Proteomics Protein biomarkers detected through MS Data Resources： GOBIOM and FDA Website

精准医学PRECISION MEDICINE INITIATIVE (PMI） 2016 百万人的 基因组计划 建立基因检 测新方法评估 审批通道 启动TCGA 计划二期 制定政策 保护隐私和 数据安全 NIH NCI FDA ONC TCGA(The Cancer Genome Atlas）癌症基因组图谱计划，通过肿瘤的大规模测序寻找引发癌症的遗传因素

中国的精准医学 精准医学 循证医学 经验医学 精准医学定义 美国版 中国版 7月29日，在央视新闻频道播出的《朝闻天下》节目中，大篇幅地报导了“精准医学” 详细介绍了“精准医学”的概念、发展和应用。 11月30号，央视再度聚焦精准医学，提出我国正在制定“精准医学”战略规划，这一计划也将被纳入到“十三五重大科技专项”。 精准医学定义 根据患者的临床信息，应用现代遗传技术、分子影像技术、生物信息技术，结合患者的生活环境和方式，实现精准的疾病分类及诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗方案。 循证医学 经验医学 精准医学 主要聚焦 恶性肿瘤 通过单一基因 组学研究对疾病 实现精确分类 前瞻性布局，整合 基因组、蛋白质组 、转录组、代谢组 等生命组学研究， 意在挖掘多层次 分子信息 聚焦我国高发重大疾病问题：包括肿瘤、心脑血管、代谢性疾病、免疫性疾病及罕见病 美国版 中国版

生命组学---助力疾病的预防、诊断和治疗 DNA RNA Proteins Metabolites Lipids 携带遗传信息 机体功能的 真正执行者 环境因素 Genomics Transcriptomics Proteomics Metabolomics Lipidomics 基因组学 疾病发生的可能性 转录组学 疾病很有可能发生 蛋白组学 疾病是否发生 以及发生的进程 代谢组学 已发生过了 Genotype基因型 Phenotype表型 蛋白质组学

蛋白质组学助力精准医学 精准的诊断 精准的预防 精准的治疗 特异性诊断生物标记物的发现（卵巢癌标志物OVA1，结肠癌标志物 SimpliPro Colon™，肺癌标志物Xpresys™ Lung） 精准的预防 暴露组学---疾病与环境（农药、环境污染物等） 营养组学---营养与健康（吸烟饮酒、饮食习惯） 精准的治疗 优化诊疗效果，减少无效或过度治疗，实现个体化治疗（BRCA1 基因突变） 监测疗效、判断预后（甲状腺癌术后标志物Thyroglobulin）

蛋白质组学生物标志物研究流程 biomarker发现 biomarker验证 biomarker确证、检测 DDA DIA PRM

血浆样本的复杂性 血浆样品的特点 血浆蛋白质丰度分布 传统质谱无法精确定性定 量极低丰度蛋白 有创采集，样品量有限 (<μg) 高度复杂 (动态范围达11-12个数量级) 高丰度蛋白质的影响（丰度前22位的占全部 蛋白质质量的99%） 血浆样品的特点 传统质谱无法精确定性定 量极低丰度蛋白 Orbitrap的超高灵敏度保 证低丰度蛋白质的定性定 量 血浆蛋白质丰度分布

血浆biomarker发现：早期心肌损伤相关标志物 研究人员：美国哈佛-麻省理工博德研究所、麻省总医院 样品采集方案：肥厚型梗阻性心肌病人实施酒精消融术过程中，在四个时间点采集外周血（ n=4），包括：基准点、酒精消融术后10分钟、60分钟、240分钟，基准点为导管布置后与酒精进入冠状窦前的时间点。 实验流程如下： IgY14+supermix Orbitrap Mol Cell Proteomics. 2015;14(9):2375-93.

血浆biomarker发现：早期心肌损伤相关标志物 迄今最深度的血浆蛋白质组定量实验，共鉴定血浆蛋白5304个，蛋白丰度跨越了9个数量级。 如cardiactroponins(肌钙蛋白) I和T，这两个早期心肌损伤标志蛋白(浓度在10-12g/mL水平)，在 所有病人样品中都被鉴定并定量。 一共发现333个蛋白的表达量有显著改变。其中约90%的蛋白上调，如myoglobin ( 肌红蛋白 MB)，creatine kinase B (肌酸激酶B，CKB)，creatine kinase M (CKM)，fatty acid binding protein (脂肪酸结合蛋白 FABP)，以及全部的Troponins ((肌钙蛋白，TNNT2, TNNI3, TNNC1, TNNC2)。另 有38个蛋白表达下调。发生变化的蛋白根据不同时间点的变化趋势被进一步聚类为五组。 筛选到的显著差异蛋白可用于后续的验证。 深度 VS 便捷性 重复性 通量 Mol Cell Proteomics. 2015;14(9):2375-93.

Minimalistic Proteomics---血浆蛋白质组分析新流程 建立了简单易用、高自动化、高重复性的血浆蛋白质组分析流程 Cell Systems 2, 185–195, 2016

Minimalistic Proteomics---唾液蛋白组分析揭示口腔菌群动态 建立了简单易用、高自动化、高重复性的唾液蛋白质组分析流程 定量分析8位健康人2个不同时间点的唾液蛋白组 来自50个细菌属的超过2000种细菌蛋白被定量 蛋白组学分析结果与人类基因组计划中的测序数据相吻合 组学与临床的对接和转化是大势所趋…… Grassl et al. Genome Medicine (2016) 8:44

全新发布：医学中的蛋白质组学应用文集 甄选了五十余篇近五年基于Orbitrap质 谱的高水平文献进行综述，提炼蛋白质 组学应用于临床研究的方法、思路。 十五种疾病 恶性肿瘤、心血管疾病、泌尿系统疾病、 代谢性疾病等 三类生物样本 体液 (血清血浆、尿液) 组织(常规组织、活体穿刺、石蜡包埋) 细胞 不同样品种类的前处理方法和研究思路 . 资料索取请联系：jing.li@thermofisher.com

蛋白质组学生物标志物研究流程 biomarker发现 biomarker验证 biomarker确证、检测 DDA DIA PRM

大规模验证：临床样本转化为数字样本的DIA定量策略 活检样本 数字样本 DIA（数据非依赖采集模式）是一种 全息质谱采集模式，能够将小量的组 织样本转变成永久性的数字文件，并 具有可溯源性，随时进行数据的二次 挖掘 活体组织检查（biopsy）取出的组织 样本的量非常有限并且不可再生；十 分适合用DIA策略将临床样本转化为 数字样本 大队列临床样本数目较多，相比基于 标记的定量策略，DIA具有成本低的 优势；相比DDA分析策略，DIA具有 更理想的重复性

DIA应用于尿液生物标志物研究 儿童突发腹痛 诱因？ 2.75 快速技术流程： 样品前处理在2.75小时内完成 LC-MS DIA 方法（30分钟梯度） 构建尿蛋白数据库 标志物发现： Myeloperoxidase (PERM) 120-fold in UTI（尿路感染），AUROC=0.968 Cystatin-B (CYTB) 5.8-fold in OC（卵巢囊肿） ，AUROC=0.91 J. Proteome Res. 2015, 14, 4752−4762

DIA解决方案 资料索取请联系：jing.li@thermofisher.com

蛋白质组学生物标志物研究流程 基础研究 biomarker发现 DDA biomarker验证 DIA biomarker确证、检测 PRM 临床应用

蛋白质组学的临床转化面临挑战 组学技术日趋成熟 FDA审批蜗行依旧 蛋白质组学相关marker研究 VS FDA批准marker FDA approved marker Published papers Jean Charles Sanchez，Univeristy of Geneva，HUPO2015

生物标志物验证的周期性 Analytes Discovery Approved by FDA Commercialised Timing（years） PSA(前列腺特异抗原) 1979 1985 1996 17 Troponin(肌钙蛋白) 1960 1995 35 BNP(脑尿钠肽) 1969 2000 2003 34 D-dimer(D-二聚体) 1975 1989 20 S100b 1967 - 1997 >40 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白) 1977 >35 提升标志物验证的便捷性，加速转化的效率 Jean Charles Sanchez，Univeristy of Geneva，HUPO2015

生物标志物验证的便捷性---基于Orbitrap的PRM定量优势 (1) 依托于发现阶段的质谱平台，无需方法转移，快速实现上下游的统一 (2) 无需优化碰撞能量，无需指定子离子，方法开发简单 (3) 高分辨扫描，选择性高，有效排除临床样本中复杂基质干扰 4) 谱图可以直接检索数据库，同时完成定性、定量

PRM临床应用实例 SAA (血清淀粉样蛋白)是急性期反 应蛋白，分为SAA1与SAA2两种亚 型，序列同源度高达90%，抗体 无法有效区分。 SAA1和SAA2同时存在SNP，包含 多个不同的等位基因编码，分别 为SAA1 α/β/γ 与SAA2 α/β。 血浆中SAA不同亚型/SNP可能与恶 性肿瘤的发生和转移密切相关。 本实验开发了SAA的PRM定量流程， 用于27例非小细胞肺癌和20例正 常人血浆样品中的标志物验证。 Proteomics 2015, 15, 3116–3125

PRM临床应用实例 亚型水平定量 SNP水平定量 肺癌 对照 定量方法：选择强度最高的子离子 最为定量离子，其他5个子离子用于 和谱图库匹配进行定性确证。 定量结果：9.6-104.2ng/mL(LOQ) 亚型水平定量 SNP水平定量 肺癌 对照 Proteomics 2015, 15, 3116–3125

蛋白质组学生物标志物研究三阶段 biomarker发现 DDA biomarker验证 DIA biomarker确证、检测 PRM 实验室自建项目 LDTs 体外诊断 IVD

FDA释放积极信号 探究在哪些标志物检测方面质谱有取代免疫学方法的可能性； 直至此次workshop为止，FDA尚未批准任何一个基于质谱的IVD方案用于蛋白质或多肽类生物标志物的定量 一些基于质谱的创新检测方法，主要通过LDTs服务于临床

基于质谱方法的蛋白质/多肽生物标志物LDTs检测项目

赛默飞质谱生物标志物研究中心（BRIMS） Thermo BRIMS中心于2005年建立于美国马萨诸塞州剑桥，毗邻麻省总医院等美国顶尖医院，致力于以质谱定量技术为基础的临床生物标志物研究，并最终应用于临床诊断市场 合作遍布美国的大型医院和第三方医学诊断实验室 Dr. Bruno Domon 与Nuclea Biotechnologies合作开发了二型糖尿病人血浆中Insulin及类似物的orbitrap质谱检测方法，并通过了CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证，意味着该质谱检测业务可用于临床指导。

国内利好政策 通知中明确指出，对于未列入《医疗机构临床检验项目目录（2013年版）》，但临床意义明确、特异性和敏感性较好、价格效益合理的临床检验项目，应当及时论证，满足临床需求 卫计委对LDTs项目开闸放水，国内体外诊断行业迎来发展良机

政策利好，质谱在哪些方面可有所为 临床检测：质谱 vs 免疫学方法 标志物存在蛋白质变异体 ● SNP 导致出现蛋白质变异体，免疫学方法识别区分致病和非致病突变 标志物检测受自抗体影响 ● 自抗体存在导致免疫学方法定量结果不准确 标志物存在不同的proteoforms ● 免疫学方法存在交叉反应问题 蛋白质标志物集（ Protein panels ） ● 需要同时检测多个生物标志物，免疫学方法无法满足通量要求

总结 蛋白质组学是遗传信息、环境因素、生活习惯的多因素的综合体现，最能反映疾病 是否发生及发生的进程，可从精准治疗、诊断、预防三个方面助力精准医学计划的 开展； Orbitrap超高分辨质谱在分辨率、准确度、稳定性、灵敏度方面具有显著的优越性， 基于Orbitrap质谱多种定量技术(DDA、DIA、 PRM)可用于疾病生物标志物研究的不 同阶段(发现、验证及最终确证) ，实现了上下游的无缝衔接； 依托于BRIMS 10年的积累以及蛋白质组学优势，Thermo在蛋白质/多肽生物标志物 临床定量方面会持续投入，引领实验室自建项目(LDTs)和体外诊断(IVD)市场，助力 精准医学研究。

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