天然产物化学实验 药物化学教研室

实验主要内容 实验一、硅胶薄层色谱板的制备和硅胶色谱柱的填装(1) 实验二、芦丁的提取、分离与鉴别(2,3) 实验三、冬凌草甲素的提取、分离与结构鉴别(4,5) 实验四、人参皂苷的提取、分离与结构鉴别(6,7)

实验三、冬凌草甲素的提取、分离和鉴别

背景介绍 冬凌草为唇形科香茶菜属多年生草本植物，又名碎米桠、 冰凌草、山香草等，广泛分布于黄河流域及其以南广大地 区，植物资源十分丰富。特别是河南省的冬凌草曾被收入 《中国药典》，具有明显的抗癌活性，已作为市售抗菌、 消炎，抗癌药物在临床上广泛应用。 已有研究结果表明，香茶菜属的其他植物与冬凌草一样， 冬凌草甲素含量相当丰富。 1972年，河南省医科所在济源县发现了冬凌草，此后，河南省医科所、中国科学院昆明植物研究所等单位对其进行了多种科学研究。1977年，冬凌草被收入《中华人民共和国药典》。

近年来，研究人员在济源冬凌草中分离得出了具有显著生理活性的冬 凌草甲素、冬凌草乙素、冬凌草丙素和冬凌草丁素，其中冬凌草甲素 和乙素均为冬凌草抗肿瘤的有效成分，同时具有明显的抗菌消炎效果。 目前，济源冬凌草被广泛用于治疗慢性咽炎、扁桃体炎、口腔炎，并 作为治疗食管癌、胰腺癌等症的辅助治疗药物用于临床。

一、实验目的 1. 以冬凌草甲素为实例学习二萜类成分的提取分 离方法。 2. 掌握二萜类成分的主要性质及鉴定方法。

二、实验原理 冬凌草富含对映-贝壳杉烷类二萜。其基本骨架 结构如图，为四环二萜类。生物活性研究表明，D 环有α，β不饱和环戊酮结构的该类二萜，对多种 肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，为冬凌草抗癌作 用的物质基础。其中的主要成分是冬凌草甲素。 冬凌草甲素（Oridonin） 骨架结构

冬凌草甲素是具有中等级性的7，20-环氧型对映-贝 壳杉烷类二萜化合物。无色晶体，易于结晶，纯化， 且纯化物在甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂 中溶解度较小。根据其物理和化学性质，提取分离方 法可有多种。本实验采用70%丙酮/水室温浸泡提取， 减压浓缩至无丙酮味、冷却、放置、过滤除去叶绿素。 滤液再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得浸膏。浸膏应用 柱层析和重结晶的方法来分离纯化冬凌草甲素。 结构鉴定：以TLC方法，与冬凌草甲素标准品进行对 照。

三、实验仪器及试剂 1. 仪器：层析柱(25mm×500mm)，分液漏斗 （500ml），旋转蒸发仪，圆底烧瓶（100ml、 24#，2个；250ml，29#，1个），缓冲瓶 （24#/29#），硅胶GF254薄层层析板，层析缸， 电吹风，滴管，量筒（100ml，10ml），台秤， 电炉，镊子，纱布，脱脂棉，青霉素瓶 2. 试剂：柱层析硅胶（200-300目），5%浓 H2SO4/无水乙醇溶液，冬凌草甲素标准品，乙酸 乙酯、氯仿、甲醇、丙酮。

四、实验步骤 将干燥的冬凌草叶研磨成细粉。 2. 提取 1. 植物原料准备 将干燥的冬凌草叶研磨成细粉。 2. 提取 取粉碎后的冬凌草叶200g用70%丙酮/水1000ml 室温浸泡3天，将提取液减压浓缩至无丙酮味，冷 却，过滤除去色素。滤液用乙酸乙酯80ml萃取2 次（80ml*2），减压浓缩乙酸乙酯萃取液至干燥 起泡，得粉末状浸膏。

柱层析基本操作程序 检查柱子 上样：干法， 湿法 装柱：干法， 湿法 洗脱：根据TLC 情况配置洗脱液 收集：检测 方法选择 使用常压或减压蒸馏， 冻干等方法除去溶剂

二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 1、装柱 操作要点：装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。 有干法装柱和湿法装柱两种方法 （1）干法装柱：将硅胶通过漏斗装入柱内，中间不应间断，形成一细流慢慢加 入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后， 打开下端活塞，然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气，并保持一定液面。 （2）湿法装柱：将最初准备使用的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂 缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内（或将硅胶与适量洗脱剂调成混 悬液慢慢加入柱内，），硅胶依靠重力和洗脱剂的带动，在柱内自由沉降，此间 要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面，直至把硅胶加完并在柱内沉降 不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗 脱剂液面至一定高度。

二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 2、上样 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，制成体积小、浓度高 的样品溶液，加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂， 则将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量硅胶（不超过柱中硅胶全量 的1/10）与其拌匀，除尽溶剂，将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶（始终 保持洗脱剂有一定的液面），再覆盖一层硅胶即可。 上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持硅胶上端表面平整；上样 量为硅胶的1/60~1/30。

二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 3、洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，一般TLC展开时Rf 值为0.2~0.3 的溶剂系统是最佳的洗脱系统，采用梯度洗脱法洗脱。 先打开柱下端活塞，保持洗脱剂流速1~2滴/秒。上端不断添加洗脱剂 （可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近）。如单一溶剂洗脱 效果不好，可用混合溶剂洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗 脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。

二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 4、收集,检测并处理 收集：等份收集洗脱液，每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗 脱液采用薄层定性检查，合并含相同成分的洗脱液。 检测：紫外显色，显色剂显色等 处理：经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体 成分的混合物，不易析出单体成分的结晶。则需要进一步层析或用其他 方法分离。

四、实验步骤 3. 层析分离 取上述粉末状浸膏2.0g，用甲醇完全溶解，3.0g硅胶拌样， 干燥后，干法上柱，上柱用硅胶40g。用氯仿/甲醇（20： 1）洗脱，每次流分体积为50ml，流分体积约300ml时， 冬凌草甲素被洗脱下来。 4. TLC鉴定 样品：冬凌草甲素标准品 展开剂：氯仿/甲醇（10：1）溶液 TLC薄层用5%浓H2SO4/无水乙醇显色，与标准品对照进 行鉴定。

五、注意事项&讨论 注意事项 1. 正确使用旋转蒸发仪，先打开冷凝水，再通电源。减压 时防止浓缩液冲出。 2. 乙酸乙酯萃取液，不要带水。 1.乙酸乙酯萃取液一旦引入水会出现什么结果？ 2.常用上柱方法有那些？ 有无其他可能的提取分离冬凌草甲素的方法？