Enzyme 第10章 酶的作用机制和酶的调节

一、酶的活性部位 ( active site ） 活性中心（active center) ——与酶活力直接相关的区域 局限在酶分子的特定部位

结合中心：与S结合 决定酶促反应的专一性 催化中心：促进S发生化学变化 决定酶促反应的性质 活性中心

（一）必需基团 ——与酶的催化活性直接相关的化学基团 常见：His咪唑基、Ser-OH、 Gluγ-COOH、Cys-SH、Asp-OH 位于活性中心 必需基团 活性中心以外， 稳定分子构象 非必需基团

底 物 活性中心以外的必需基团 催化基团 结合基团 活性中心

（二） 酶活性部位的特点 1、几个残基+辅助因子（单纯/结合） 2、在空间构象上集中到一起（单体/寡聚） 3、疏水空穴 4、通过次级键与底物结合 5、与底物诱导契合 6、活性中心构象具有柔韧性和可塑性

酶 AA残基 活性中心AA 核糖核酸酶 124 H H K R D E 溶菌酶 129 D E 胰凝乳蛋白酶 241 H D S 羧肽酶A 307 R E Y Zn2+ 胰蛋白酶 223 H D S

二、研究酶活性部位的方法 1.酶分子侧链基团的化学修饰法 化合物 活性部位AA残基侧链基团 ↓ 共价结合 水解酶，确定一级结构位置

（1）非特异性共价修饰 ——推测某基团是否在活性中心 某基团被修饰后： 酶活力改变：为必需基团

（2）特异性共价修饰 ——试剂专一修饰活性部位某AA，使酶失活。 如：二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰E Ser-OH

(3)亲和标记法 ——与S结构相似的共价修饰剂 能被专一地引入活性部位，接近S结合位点 其活泼的化学基团可与活性部位某一基团 形成稳定的共价键

对甲苯磺酰－L－苯丙氨酸乙酯 (TPE) 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶 对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）

2.动力学参数测定法 3.X射线晶体结构分析法 活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关 通过动力学方法求有关参数， 对酶活性部位化学性质作出判断。 3.X射线晶体结构分析法

4.定点诱变法 利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的DNA顺序，改变其中某AA后，测定酶活性的变化。

三、酶催化高效性的机制 诱导契合机制 酶与底物靠近 定向 酶与底物相互诱导变形 契合成中间产物 产物脱离 酶催化的本质：降低反应的活化能。

酶促反应降低活化能 过渡态 能 量 改 变 初 态 终 态 活 化 过 程 非催化反应活化能 一般催化剂 反应活化能 酶促反应活化能 反应总能量变化 终 态 活 化 过 程 酶促反应降低活化能

（一）底物和酶的邻近效应和定向效应 定向 靠近 静电吸引疏水作用 底物 酶

（二）底物的形变和诱导契合 诱导 互补性 结构变化 契合 能否契合— 专一性的由来

产物脱离 酶复原－催化剂

羧肽酶 A

羧肽酶催化中的电子云形变 ＋

电子云形变 C＋=O－ 靠近 定向 极性专一性契合区 ＋ 注意 C端确认区 H2+N＝C 精氨酸

（三）酸碱催化 酶活性中心提供H+/H+受体使敏感键断裂的机制。 酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH) + H+ EH E- H2O EH + OH- + H+ A- : B+ AH + B+ 碱催化(失电子态) A- : H+ + E-COO- A- + E-COOH E-COO- + H+

碱催化 酸催化 ＋

使肽键失稳 稳定活性中心 吸附羧氧原子

（四）共价催化 ——酶活性中心亲电/亲核基团参与S敏感键断裂的机制。 亲电基团——带正电荷性质的基团 亲核基团——带负电荷性质的基团

中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。 （不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。） ¨ -OH -SH ¨ - NH2 咪唑基 亲电催化 A: Mg ¨ A + 2B+ 2A- : 2 B+ + Mg2+ 亲核催化 ¨ A- : B+ A- : + HO :B + -OH

＋

－OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)

（五）金属离子催化 1、需要金属离子的酶 （1） 金属酶 (metalloenzyme) 含紧密结合的金属离子 （2）金属激活酶( metal-activited enzyme) 含松散结合的金属离子

2、金属离子的作用 A、参与底物反应的定向 B、通过价态改变参与电子转移 C、通过静电稳定/屏蔽负电荷

（六）多原催化和协同效应

（七）活性部位微环境的影响

四、酶催化反应机制的实例 （一）溶菌酶（lysozyme）

（二）胰凝乳蛋白酶 疏水口袋 活性位点残基

4.丝氨酸蛋白酶的催化机制 催化三联体 稳定His的正电形式 亲核攻击

胰蛋白酶 锌蛋白酶 胰凝乳蛋质酶 蛋白质 丝氨酸蛋白酶 水解酶 弹性蛋白酶 天冬氨酸蛋白酶 凝血酶 巯基蛋白酶 趋同进化（convergent evolution）：催化三联体 趋异进化（ divergent evolution）：底物专一性

（三）烯醇化酶（enolase） ——作用需要金属离子

碱催化

稳定中间产物 酸催化

五、酶活性的调节控制

（一）别构调控（allosteric regulation） 1、定义 别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。 别构酶：具有别构现象的酶。 别构剂：能使酶分子发生别构作用的物质。

2、 别构酶的特点 别构激活剂 别构抑制剂 （1）多亚基 一部分亚基有活性中心， 另一部分有别构调节中心

①天冬氨酸转氨甲酰酶 ATP 别构激活剂 CTP 别构抑制剂

调节亚基 催化亚基

② 3－磷酸甘油醛脱氢酶 具有负协同效应的别构酶代表

（2）别构酶的动力学 S形曲线（正协同） 表观双曲线（负协同效应）

= 81 90%V时 [s] 10%V 时[s] 当V=90％V 0.9Km=0.1[S] ［S］＝9Km 当V=10％V = 81 当V=90％V 0.9Km=0.1[S] ［S］＝9Km 当V=10％V ［S］＝1/9Km

a 、仅底物是别构调节物 S曲线：正协同＜81—V↑随［S］↑而加快 底物是别构抑制剂 底物是别构激活剂 2米氏曲线 1负协同 3正协同 3 2 1 V 10%V 90%V 0 [S] 底物是别构激活剂 S曲线：正协同＜81—V↑随［S］↑而加快 双曲线：负协同＞81—V↑随［S］↑而减慢

b、当其他别构物参与调节时 别构激活 别构抑制 V [S] 底物敏感区 整体上产生激活、抑制现象 改变了调节的敏感区位置

（3）K型效应物和V型效应物： K0.5：别构酶催化反应达到1/2 Vmax时的[S] 改变K0.5不改变Vmax：K型效应物 改变Vmax不改变K0.5 ：V型效应物

A为K型效应物 B为V型效应物 1.未加效应物；2.加激活剂；3加抑制剂 v v 2 Vmax 2 1 3 Vmax 1 3 [S] [S] K0.5 [S] 1.未加效应物；2.加激活剂；3加抑制剂

B为V型效应物 A为K型效应物

（4）脱敏作用 别构酶经加热或用化学试剂等处理，可引起别构酶解离，失去调节活性。 脱敏后表现为米氏酶动力学双曲线

3、别构酶调节酶活性的机理 1、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、MWC模型） 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 该模型的要点 :

2、序变模型（sequential model，也称KNF模型） 1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。 该模型的要点 :

（二）酶原的激活 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 酶原激活的机理: 酶 原 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 在特定条件下

赖 缬 天 甘 异 组 丝 S 46 183 肠激酶 胰蛋白酶原 活性中心 胰蛋白酶原的激活过程 胰蛋白酶

肠激酶启动的酶原激活 肠激酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶原 六肽 + 弹性蛋白酶原 弹性蛋白酶 + 碎片 胰凝乳蛋白酶原 α-胰凝乳蛋白酶 +二肽 羧基肽酶原A 羧基肽酶A + 碎片 肠激酶 自身催化 肠激酶启动的酶原激活

（三）可逆的共价修饰 ——通过其它酶对其多肽链上的某些基 团进行。 可逆的共价修饰，使酶处于活性/非活性的互变状态，从而调节酶的活性。

酶 酶-P 蛋白激酶，磷酸化 磷酸酶，脱磷酸化 由核苷三磷酸（ATP）提供磷酸基 酶的活性形式： 可能是磷酸化也可能是脱磷酸化

R

生理条件下： 几乎所有的蛋白激酶都以ATP为磷酸基的供体，几乎所有的磷酸化反应都需Mg2+。 （1）Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu┉P-O键连接 （2）Lys、Arg、His┉P-N键连接 底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基有两类：

主要是 Ser Thr

Ca2+ 依赖性 蛋白激酶（PKC)

六、同工酶（isoenzyme） （一）定义： 催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。

（二）特点： 1、都是寡聚酶 2、不同的亚基组成 3、不同亚基的活性中心非常相似 4、组织分布部位不同 5、所催化的反应有侧重点

如：

生理及临床意义 在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5

a b 2 1 2 3 1 4 3 5 酶活性 5 4 酶活性 迁移位置 迁移位置 (a) LDH同工酶电泳图谱 (b) （a）正常人LDH同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱