实验四 细菌的分布与外界因素对细菌的影响

目的要求 1．了解细菌在自然界和正常人体的分布； 2．掌握物理因素、化学因素、生物因素对细菌的不利影响； 3．理解消毒、灭菌及无菌操作的重要意义；

基本概念 1、消毒：用物理或化学方法杀死物体上病原微生物的方法。如注射前用2%的碘酒在局部皮肤涂擦；用75%的酒精棉球擦拭体温表等。用于消毒的化学药物称为消毒剂。 2、灭菌：用物理或化学方法清除或杀灭物体上所有微生物（包括病原微生物、非病原微生物、繁殖体和细菌的芽胞）的方法。 3、无菌操作：防止微生物进入机体或物体的操作方法，称无菌操作或无菌技术。如外科手术，细菌接种等。

实验材料 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌； 培养基：普通平板、液体培养管 试剂：2%碘酒棉球、75%酒精棉球、药敏纸片、无菌生理盐水 器材：接种环、酒精灯、镊子等

实验内容与方法 一、细菌分布 （一）细菌在自然界的分布 （二）细菌在正常人体的分布 二、外界因素对细菌的不利影响 （一）湿热对细菌的杀灭作用 （二）紫外线对细菌的杀灭作用 （三）消毒剂对细菌的杀灭作用 （四）抗生素对细菌的杀灭作用

一、细菌的分布 1、空气中的细菌检查（1块平板） 2、水（自来水）中细菌的检查（1块平板） 3、周围环境中细菌检查（1块平板） 自由发挥（如笔、硬币） 4、皮肤（手）上细菌的检查（结合化学消毒剂试验）（1块平板） 5、咽喉中细菌的检查（1块平板）

（一）湿热对细菌的杀灭作用 （二）紫外线对细菌的杀灭作用 （三）消毒剂对细菌的杀灭作用 （四）抗生素对细菌的杀灭作用 二、外界因素对细菌的影响 （一）湿热对细菌的杀灭作用 （二）紫外线对细菌的杀灭作用 （三）消毒剂对细菌的杀灭作用 （四）抗生素对细菌的杀灭作用

（一）温度对细菌的影响 热力杀菌的原理：是通过加热脱水干燥和大分子变性。可使菌体蛋白质变性或凝固，酶失去活性，新陈代谢发生障碍，细菌因而死亡。 目的要求： 认识高温（煮沸法）对细菌繁殖体和芽胞的作用 材料： 1、菌种：枯草杆菌（有芽胞） 大肠杆菌 （无芽胞） 2、肉汤培养基、水浴锅

实验方法 检测对象：大肠杆菌（或金黄色葡萄球菌）、枯草杆菌; 步骤：分别取上述两种细菌，设置对照组后，分别沸水浴5-10min， 37℃培养24h，观察结果。 枯草杆菌 金黄色葡菌球菌或大肠杆菌 100 ℃ 10m + － 37℃培养24h后

枯草杆菌 枯草杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 100℃ 5min 100℃ 5min 37℃ 24h 菌膜 澄清 浑浊

大肠杆菌 大肠杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 煮沸杀菌后细菌生长状况 普通条件培养下细菌生长状况

（二）紫外线对细菌的影响 原理：紫外线可以诱发细菌DNA形成胸腺嘧啶二聚体，使细菌死亡。 取有芽胞细菌（枯草杆菌）、无芽胞细菌，设置对照后，以紫外线照射30min， 37℃培养24h，观察结果。 枯草杆菌 金黄色葡菌球菌或大肠杆菌 紫外线30min + － 37℃培养24h后

紫外线杀菌的结果 uv30’ 培养箱 班级、姓名/学号、大肠 枯草 接种大肠杆菌 接种枯草杆菌

（三）消毒剂对细菌的影响 化学消毒剂杀菌的原理：使微生物蛋白质凝固与变性，致使细菌代谢发生障碍而死亡；干扰微生物酶系统和影响其代谢；损伤细胞膜：醇类、酚类、表面活性剂等损伤细菌细胞膜，引起细胞膜的渗透性改变，导致细菌死亡。 消毒剂：2%碘酒棉球，75%酒精棉球。 方法：以碘酒（酒精棉球）消毒手指前后，分别涂抹平板培养基， 37℃培养24h后，观察结果。

（四）抗生素对细菌的影响（药敏试验 ） 原理 影响细胞壁的合成：β-内酰胺类抗生素，如青霉素、头孢曲松。 影响细胞膜的功能：多黏菌素、两性霉素B； 影响蛋白质的合成：氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类。如庆大霉素为氨基糖苷类。 影响核酸代谢：喹诺酮类、利福霉素类、磺胺类。 如丙氟哌酸为第二代喹诺酮类抗菌药；

方 法 在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。 方 法 在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。 然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。 贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。

药敏纸片 庆大霉素、头孢曲松、青霉素、丙氟哌酸 青 青 青 青

药敏试验结果判定标准 抑菌圈直径（毫米）敏感性 ＞20mm极敏感 15-20mm高敏感 10-14mm中敏感 ＜10mm低敏感 0不敏感 药敏试验结果判断 药敏试验结果判定标准 抑菌圈直径（毫米）敏感性 ＞20mm极敏感 15-20mm高敏感 10-14mm中敏感 ＜10mm低敏感 0不敏感 青 Ⅳ 抑菌圈 链 红

葡萄球菌

大肠杆菌

常用药物抑菌圈直径大小来判断结果的标准，如下 抗菌药物 中介 敏感 AMK9阿米卡星 30ug ≤14 15-16 ≥17 CLI 克林霉素 2ug ≤14 15-20 ≥21 GEN庆大霉素 10ug ≤12 13-14 ≥15 OXA苯唑西林 1ug ≤10 11-12 ≥13 PEN青霉素 10U ≤28 - ≥29 AMS舒巴坦 10/10ug ≤11 12-14 ≥15 AMP氨卞西林 10ug ≤13 14-16 ≥17 PIP哌拉西林 100ug ≤17 - ≥18 FZN头孢唑碄 30ug ≤14 15-17 ≥18 CAZ头孢它定 30ug ≤14 15-17 ≥18 CIP环丙沙星 5 ug ≤15 16-20 ≥21 ATM氨曲南 30ug ≤15 16-21 ≥22 FRX头孢呋辛 30ug ≤14 15-17 ≥18 IMP亚氨配南 10ug ≤13 14-15 ≥16 VAN万古霉素 30ug ≥15 SXT复方新诺明1.25/23.75ug≤10 11-15 ≥16