抗生素类药物的分析Analysis of Antibiotics Drug

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第二节 定量分析方法特点 (一)容量分析法的特点 容量分析法是将已知浓度的滴定液由滴定管滴加到待测药物的溶液中,直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止,然后根据滴定液的浓度和消耗的体积,就可计算出被测药物的含量。
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抗生素类药物的分析Analysis of Antibiotics Drug 第十六章 抗生素类药物的分析Analysis of Antibiotics Drug

发展 明朝,李时珍《本草纲目》,霉豆腐渣 1928,伦敦圣玛丽医院,弗莱明 1939年,牛津的病理学教授霍华德·弗洛里与生化学家恩斯特·钱恩 Ernst Chain Howard Florey Sir Alexander Fleming

1944的诺曼底登陆 1943年,瓦克斯曼,链霉素 

抗生素殺菌的機制 基本上分成五種方式: 抑制細胞壁合成 破壞細胞膜 抑制蛋白質合成 抑制 DNA 正常功能 對抗代謝物

内容 第一节 概 述 第二节 β–内酰胺类抗生素 第三节 氨基糖苷类抗生素 第四节 四环素类抗生素 第五节 抗生素类药物中高分 子杂质的检查 第六节 抗生素药物体内药物 分析示例 思考与练习

基本要求 一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。 二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。 三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。 四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。 五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查和抗生素的体内药物分析。

第一节 概 述 生物(包括微生物、植物、动物)在其 生命活动中产生的(或并用化学、生物或生 化方法衍生的),能在低微浓度下有选择的 第一节 概 述 生物(包括微生物、植物、动物)在其 生命活动中产生的(或并用化学、生物或生 化方法衍生的),能在低微浓度下有选择的 抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。 抗生素 的定义

一、 抗生素药物的特点 化学纯度 较低 2. 活性组分易发生变异 生物合成 (发酵) 3. 稳定性差 2. 化学合成或半合成 抗生素的特点 抗生素的来源 化学纯度 较低 2. 活性组分易发生变异 3. 稳定性差 生物合成 (发酵) 2. 化学合成或半合成

二、抗生物类药物的分类 1、根据抗生素的生物来源分类 2、根据抗生素的作用对象分类 3、根据抗生素的作用机制分类 4、根据抗生素的化学结构分类

大环类 四环素类 tetracyclines 氨基糖苷类 aminoglycosides β–内酰胺类 β-lactams 其他类 抗肿瘤类 分类

三、抗生素类药物的细菌耐药性 1、耐药性的种类 固有耐药性(intrinsic resistance) 获得性耐药性(acquired resistance) 2、耐药的机制 (1)产生灭活酶,使抗菌药失活 (2)抗菌药物作用靶位改变 (3)降低细菌外膜通透性 (4)影响主动流出系统

四、抗生素类药物的质量分析 1)鉴 别 2)检查 3)含 量 理化方法: 增加: 异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌 ii .组分分析,悬浮时间与抽针试验,聚合物,杂质吸收度 理化方法: 化学法; 色谱法; 光谱法 含量(理化法)或 效价(微生物检定法)测定 1)鉴 别 2)检查 3)含 量

微生物检定法与理化法的比较 微生物检定法 理化法 以抗生素对微生物的杀伤或抑制程 度为指标衡量抗生素的生物效价 根据抗生素结构特点,利用其 特有的理化性质测定其含量 已知或新发现的抗生素、精致品或 粗制品均能测定 测定化学结构已知、已提纯的 抗生素 灵敏度高、样品需用量小、反映抗 生素的医疗价值,但操作步骤多、 费时、误差大 迅速、准确、专属性高、样品 需用量小、操作简单、省时

抗生素的活性以效价单位来表示: 每ml或每mg中含有某种抗生素 的有效成分的多少, 用单位(u)或µg表示。 1mg青霉素G钠盐定为1667单位 1mg庆大霉素定为590单位 1mg硫酸卡那霉素定为670单位

第二节 β–内酰胺类抗生素 青霉素类(penicillins) N S C H O R A B 母核(6-氨基青霉烷酸,6-APA) 3 1 第二节 β–内酰胺类抗生素 N S C H 3 O 1 2 4 5 6 7 R 母核(6-氨基青霉烷酸,6-APA) A B 青霉素类(penicillins)

头孢菌素类(cephalosporins) B 母核:7-氨基头孢菌烷酸,7ACA 头孢菌素类(cephalosporins)

青霉素 (青霉素钾、钠)

氨苄西林 (氨苄青霉素)

阿莫西林 (羟氨苄青霉素)

普鲁卡因青霉素

头孢氨苄

头孢拉定

头孢羟氨苄

头孢噻吩钠

一 结构与性质 (一)β–内酰胺环不稳定性 四元环张力大 不稳定因素 酰胺键易水解 干燥纯净 稳定 水溶液 不稳定 pH6-6.8 较稳定

青霉素类 某些氧化剂 酸、碱、青霉素酶 (某些金属离子) (温度) 降解失效

例 青霉素的降解反应 青霉噻唑酸 青霉醛 青霉素 青霉酸 青霉胺 CO2 α–青霉噻唑酰基羟胺酸 青霉烯酸 H2O/OHˉ 或青霉素酶 HgCl2 H2O 青霉素 青霉酸 青霉胺 100℃ pH2 CO2 α–青霉噻唑酰基羟胺酸 NH2OH pH4 青霉烯酸

降解失效 头孢菌素类 酸、碱、胺类 -内酰胺酶

旋光性 (二)手性C 青霉素类 C3 C5 C6 头孢菌素类 C6 C7 ﹡ ﹡ ﹡ ﹡ ﹡

酸性 (三)羧基 与碱金属(Na+、K+)成盐 易溶于水 Na

与有机碱(普鲁卡因)成盐 难溶于水 普鲁卡因青霉素

(四)共轭体系 UV 青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基 头孢菌素类 母核有共轭体系

鉴别试验 二、 色谱法 (一) 对照品对照法 1、 TLC法 2、 HPLC法

光谱法 (二) 1、 UV法:λmax或A 头孢唑啉钠和头孢替唑钠:16μg/ml, λmax=272nm

2、 IR法 以阿莫西林为例 3180cm-1 N-H 1250cm-1 β–内酰胺 C-O C=O 1780cm-1 O-H 1690cm-1 仲酰胺C=O

(三)呈色反应 1. 羟肟酸铁反应 NaOH • 2 HCl NOH H - b 内酰胺环 羟肟酸衍生物 Fe3+/3 H+ 呈色

H+ Fe3+/3 哌拉西林(钠) 拉氧头孢钠 头孢哌酮 (红、棕、褐)

2. 茚三酮反应 α-氨基酸 -氨基酸 茚三酮  蓝紫色

3. 双缩脲反应 似肽键 (开环分解) - 内酰胺类 碱性酒石酸铜 紫

4. 与重氮苯磺酸反应 酚羟基 重氮苯磺酸 - C H OH 橙黄色 6 5 (偶合)

5. 与变色酸-硫酸反应 △(分解) 变色酸 活泼“-CH2-” 显色

(四)各种盐的反应 1. K+、Na+的火焰反应 焰色→鲜黄色 + 醋酸氧铀锌→↓黄 Na+ 焰色→紫色 + 0.1%四苯硼钠 + Ac→↓白 K+

2. 沉淀反应(青霉素盐) 遇酸→↓ 白 青霉素 青霉素钠  青霉素钾  + H 在过量HCl或 有机溶剂中溶解

3. 重氮化 - 偶合反应 芳伯氨基 重氮化-偶合反应

三、杂质检查 1、聚合物:HPSEC(高效分子排阻色谱) 固定相:葡聚糖凝胶(sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(sepharose)

高分子杂质定量测定方法: 1)主成份自身对照法:用于高分子杂质含量较低的品种 2)面积归一化法 3)限量法:处另有规定外,规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分,一般用于混合物中高分子物质的控制 4)自身对照外标法:一般用于Sephadex G-10凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中,所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰,以供试品自身为对照品,按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量

举例:头孢他啶聚合物的测定 固定相:葡聚糖凝胶G-10( 40~120µm ) 流动相A:3. 5%硫酸铵的0 举例:头孢他啶聚合物的测定 固定相:葡聚糖凝胶G-10( 40~120µm ) 流动相A:3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液 流动相B:水;检测波长:254nm 对照品溶液:头孢他啶对照品 100µg/ml 供试品溶液:本品0.2g,精密称定,置10ml量瓶中,加入碳酸钠20mg,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。

1)系统适用性试验:理论塔板数和拖尾因子用0 1)系统适用性试验:理论塔板数和拖尾因子用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定;重复性用对照品溶液、流动相B测定。n不低于900,拖尾因子小于2.0,峰面积的RSD应小于5.0%。 2)测定方法 进样供试液,用流动相A;进样对照液,用流动相B。以外标法计算,含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。

2.有关物质和异构体 举例:头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相:ODS 流动相:0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇(62:38) 1)头孢呋辛酯Δ3-异构体的制备:头孢呋辛酯对 照品+流动相 头孢呋辛酯Δ3-异构体。 2)系统适用性试验:各异构体之间的R符合要求,头孢呋辛酯A,B异构体、Δ3-异构体及E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1. 60°C,1h hν 头孢呋辛酯E异构体

3)有关物质:主成份自身对照法 供试品:0.25mg/ml 对照品:精密量取供试品1ml,置100ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。 分别进样,供试品溶液中量取各杂质峰面积: 其中两个E异构体峰面积之和不得大于对照品两个主峰面积之和(1.0%)  Δ3-异构体峰面积不得大于对照品两个主峰面积之和的两倍(2.0%) 所有杂质峰面积之和不得大于对照品两个主峰面积之和的三倍(3.0%)

4)异构体: t‘R1 相对保留时间 r12=----- 1----被测物 t’R2 2----标准物 异构体 相对保留时间 判断 B异构体 0.9 供试液谱图中A异构体的峰面积 A异构体 1.0 与A、B异构体峰面积和之比应 为0.48~0.55。

3.吸收度 青霉素钠(钾)的检查: 供试液 1.80mg/ml, 结果判断: A280不得大于0.10 A264=0.80~0.88

4.有机溶剂 5.结晶性 氨苄西林钠(二氯甲烷,GC) 头孢哌酮(丙酮,GC) 头孢硫脒(残留溶剂,GC) 头孢他啶(吡啶,HPLC) 头孢地尼,头孢硫脒,青霉素V钾等检查。 1)偏光显微镜法 2)X射线粉末衍射法

HPLC法 四、含量测定 ChP除磺苄西林钠(微生物检定法)外 内标法+校正因子 外标法 特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用(鉴别、检查、含测)

例:头孢克洛 色谱条件: 柱:ODS 流动相:磷酸二氢钾— 乙腈(92:8) 检测波长:254nm 外标法定量

第三节 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides Antibiotics 氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取或以天然品为原料半合成制取而得到的一类水溶性较强的碱性抗生素。 链霉素 妥布霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 巴龙霉素

单糖环状分子中的半缩醛或半缩酮羟基在干燥的HCl存在下与另一分子醇或另一分子含羟基的化合物反应脱去一分子水,生产的化合物称为糖苷。这一反应称为成苷反应。

链霉素 streptomycin 链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺 苷元 链霉双糖胺 糖

链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡 萄糖胺 链霉双糖胺

巴龙霉素 paromomycin D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖 巴龙胺 巴龙二糖胺 苷元 糖

R1 脱氧链霉胺 巴龙霉糖 D-葡萄糖胺 D-核糖

巴龙霉素Ⅰ:R1=CH2NH2 ,R2=H 主要成分 巴龙霉素Ⅱ:R1= H , R2=CH2NH2 微量成分

庆大霉素 gentamycin 绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺 糖 苷元 糖

加洛糖胺 绛红糖胺 2-脱氧链霉胺

庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H

一 结构与性质 (一) 碱性 多与硫酸成盐 链霉素 3个 碱性中心 庆大霉素 5个 水溶性 溶解性 (二) 旋光性 (三)

(四) UV 苷的水解与稳定性 链霉素 pH5~7.5 庆大霉素 pH2~12 稳定 链霉素:230nm,其它无 (五) N-甲基-L-葡萄糖胺 链霉素 酸 链霉胍 + 链霉双糖胺 链霉糖重排 链霉素 碱 链霉双糖胺 麦芽酚 链霉胍 +

二、 鉴别 茚三酮反应 (一) 羟基胺和α-氨基酸 △

Molisch 试验 (二) 糠醛 H+ 氨基糖苷类 羟甲基糠醛 -萘酚 蒽酮 呈色

红紫色

链霉素 葡萄糖胺 新霉素 N-甲基葡萄糖胺反应 (三) (Elson-Morgan反应) 巴龙霉素 吡咯衍生物 红色 乙酰丙酮 OH- 水解 新霉素 葡萄糖胺 巴龙霉素 乙酰丙酮 OH- 吡咯衍生物 对二甲氨基苯甲醛 H+ 红色

(缩合)

对二甲氨基苯甲醛 H+ 红色

麦芽酚反应 (四) 链霉素特征反应 H+ 分子重排

麦芽酚 紫红

坂口反应 (五) 链霉胍特有反应 (或α-萘酚) α-萘酚 8-羟基喹啉

(六) 反应

(七)色谱法 (1)TLC法:硫酸依替米星的鉴别 点样:供试液:展开、晾干、碘蒸气中显色 对照液:硫酸依替米星同法处理 混合液:供试品+庆大霉素C1a 判断:供试液与对照液所显斑点的颜色与位 置应一致。混合液中斑点清晰分离 硅胶G板 展开剂:三氯甲烷:甲醇:浓氨溶液 (5:3:1.5)

(2)HPLC法:硫酸庆大霉素的鉴别 比较供试液与对照液各组分的保留时间。(含量测定项下条件)

(八)UV和IR nm max 230 = l 链霉素 庆大霉素无UV吸收 原料药:IR

三、 (一) 有关物质及组分分析 有关物质: HPLC 和TLC 例:链霉素B(甘露糖链霉素) 1. 来源 反应中间体 1. 来源 反应中间体 方法 ChP2005, BP用TLC的对照品 法,ChP2010HPLC

组分的测定:HPLC (二) C组分比例 不一致 规定控制各组分的相对百分含量 ChP USP BP JP 例:庆大霉素C组分测定 发酵菌种不同 工艺差别 对微生物的活性无明显差异 毒副作用和耐药性不同 规定控制各组分的相对百分含量

1. 衍生化(USP29,ChP2000) + + 氨基 邻苯二醛 巯基醋酸 pH 10 . 4 吲哚衍生物 λmax = 330nm

1-烷基-2- 烷基硫代 异吲哚衍生物

方法 离子对色谱 计算 峰面积归一化法 规定 C1 25~50% C1a 10~35% C2a +C2 25~55%

2、BP2010:HPLC-PAD(柱后衍生) 色谱柱:苯乙烯-二乙烯苯共聚物 对照品:硫酸庆大霉素 检测器:脉冲安培检测器 规定 C1 20.0~40.0% C1a 10.0~30.0% C2a +C2 40.0~60.0%

3、ChP 2010:RP-HPLC 色谱柱:ODS 检测器:蒸发光散射检测器(ELSD) 规定 C1 25~50% C1a 15~40% C2a +C2 20~50%

蒸发光散射检测器(ELSD Evaporative Light-scattering Detector) 是通用型检测器,可以检测没有紫外吸收的有机物质。 三步:雾化,蒸发,检测

(三)硫酸盐检查 EDTA配位滴定或HPLC法

四、 含量测 定 微生物检定法 HPLC法 :离子交换、离子对 、 反相HPLC法。

例 HPLC-蒸发光散射法测定硫酸依替米星含量 固定相:ODS 流动相:0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(84:16) 检测器:蒸发光散射检测器 对照品:依替米星,0.2mg/ml RSD:不大于2.0% 方法:外标标准曲线法

第四节 四环素类抗生素 4 7 6 5 8 3 D C B A 2 9 1 10 11 12

四环素(TC)tetracycline

金霉素 (CTC) chlortetracycline 氯四环素

土霉素 (OTC) oxytetracycline 氧四环素

多西环素 (DOXC) doxycycline 脱氧土霉素

美他环素(METC) metacycline

一、 结构与性质 两性 (一) 酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性 二甲胺基 弱碱性 1. 2. 与酸、碱均能成盐 临床多用盐酸盐,易溶于水 酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性 二甲胺基 弱碱性 1. 与酸、碱均能成盐 临床多用盐酸盐,易溶于水 2. 强酸或强碱中溶解度↑

(二)旋光性 UV和荧光性质 (三) 盐酸土霉素:酸性降解,绿色荧光; 碱性降解,绿色荧光,加热,转为蓝色 盐酸金霉素,碱性降解,蓝色荧光 盐酸四环素,碱性降解,黄色荧光

不稳定性 (四) 1. 差向异构化 淡黄→黑 四环素 - 4 差向四环素 pH 2 ~ 6 金霉素 4 - 差向金霉素 蓝色荧光

差向四环素 (ETC)

(土霉素、多西环素不易差向异构化)

2. 降解反应 (1)酸性下降解 四环素 脱水四环素 金霉素 脱水金霉素 λmax = 445nm λmax = 435nm 橙黄色 < 2 pH λmax = 435nm 橙黄色

脱水四环素 (ATC)

ETC ~ TC < < ATC EATC ~

(2)碱性下降解 - OH 四环素 异四环素

二、 鉴别试 验 (一)HPLC:比较保留时间一致 (二)TLC:盐酸土霉素的 鉴别 薄层板:载体:硅藻土;黏合剂:4%EDTA-Na-甘油,浓氨溶液调节pH至7.0; 展开剂:醋酸乙酯-三氯甲烷-丙酮(2:2:1),添加4%EDTA-Na 样品配制:供试品,土霉素用甲醇分别配制成1mg/ml溶液;土霉素,盐酸四环素对照品用甲醇配制成1ml中各含1mg的混合溶液 判定:氨蒸汽熏后,置紫外灯(365nm)下检视,混合溶液应显示两个完全分离的斑点,供试品溶液所显示斑点的荧光强度及位置应与相应的对照品溶液的斑点相同。

(三)IR:土霉素除外 (四)UV:最大吸收波长和最小吸收波长 (五)显色法 浓H2SO4反应 (一) 黄色 朱红色 金黄色 兰色 紫红色 盐酸多西环素 盐酸土霉素 盐酸金霉素 盐酸四环素 4 2 SO H 盐酸美他环素 橙红色 黄色 黄色

FeCl3呈色 (二) 褐色 橙褐色 深褐色 红棕色 盐酸多西环素 盐酸土霉素 盐酸金霉素 盐酸四环素 3 FeCl

三 杂质检查 有关物质 (一) 盐酸四环素 · 4-差向四环素(ETC) HPLC · 脱水四环素(ATC) · 差向脱水四环素(EATC) 三 杂质检查 有关物质 (一) HPLC 盐酸四环素 · 4-差向四环素(ETC) · 脱水四环素(ATC) · 差向脱水四环素(EATC) · 盐酸金霉素(CTC) 土霉素(OTC)

供试液:2mg/ml 对照液:供试品2ml→100ml 色谱条件:C18柱,0.1mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液(68:27:5)为流动相,流速1.0ml/min,柱温35°C,检测波长:280nm 判定:供试品色谱图中如有杂质峰,按校正后峰面积计算,OTC,ETC、CTC、ATC、EATC的校正后峰面积分别不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍(0.5%),1.5倍(3.0%)。1/2(1.0%)、1/4(0.5%)、1/4(0.5%)

杂质吸 收度 (二) Ch.P规定:一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸收度的限量 盐酸四环素 l max 268 、 355 nm

杂质吸收度

杂质吸收度 取供试品,在20~25°C时加0.8%NaOH配成每毫升10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中,在530nm处测定,其吸收度不得超过0.12。 应严格控制温度和时间

(三)残留有机溶剂:乙醇

四、 含量测定 HPLC法 盐酸四环素的测定 系统适用性试验:盐酸四环素、有关 盐酸四环素的测定 系统适用性试验:盐酸四环素、有关 物质ETC、EATC、CTC、OTC及ATC峰间分离 度均应符合要求。 定量方法:外标法以峰面积计。

固定相:ODSC18 流动相: 0.1mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液(68:27:5) 流速:1.0ml/min 柱温35°C;检测波长:280nm 操作:称取盐酸四环素约15mg,4-ETC、ATC、盐酸金霉素及ATC各约8mg,置50ml量瓶中,用0.01 mol/L盐酸溶解稀释到刻度。进样,各组分分离度应符合要求。 测定:取本品约30mg,精密称定,置50ml量瓶中,用0.01mol/L盐酸溶解稀释到刻度。另取盐酸四环素对照品30mg,同法测定。外标法计算供试品中盐酸四环素的含量。

第五节 抗生素类药物中高分子 杂质的检查 β-内酰胺抗生素是临床上常用的药物之一。同时也是较易发生不良反应的药物之一。在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。引发β-内酰胺抗生素速发型过敏反应的过敏原并不是β-内酰胺抗生素本身,而是其中存在的高分子聚合物。

1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。 M.W:1000-5000Da

蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺。致敏,如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 药物的自身聚合物,来自于生产、贮存过程。可引发过敏。 外源性杂质 内源性杂质

2、高分子杂质的基本结构与特点 1)多肽类杂质

2)聚合物类杂质

3.高分子杂质的质控方法 (1)凝胶色谱法测定高分子杂质: 凝胶色谱法原理 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。

(2)高分子杂质的控制方法 a、主成份自身对照法:用于高分子杂质含量较低的品种 b、面积归一化法 c、限量法:处另有规定外,规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分,一般用于混合物中高分子物质的控制 d、自身对照外标法:一般用于Sephadex G-10凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中,所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰,以供试品自身为对照品,按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量

自身对照外标法原理: 在Sephadex G-10 凝胶色谱系统中,由于Sephadex G-10 的排阻分子量仅为700d,因此,除部分寡聚物外, β-内酰胺抗生素中 的高分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰,其Kav = 0 。在特定的条件下, β-内酰胺抗生素由于分子间的氢键,静电相互作用,疏水相互作用等次级相互作用,可以形成缔合物,导致其表观分子量增大,此时在Sephadex G-10 凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为,即在Kav = 0 处表现为单一的色谱峰。

利用此原理,在Sephadex G-10 凝胶色谱系统中,以药物自身为对照品,测定其在特定条件下缔合时峰的相应指标,再改变色谱条件,测定样品中高分子杂质和药物分离后在Kav = 0 处的峰相应指标,按外标法计算,即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。

试验条件的选择 1.流动相种类和浓度的选择 流动相的种类与其浓度可以改变溶质的色谱行 为,实验证明,反离子PO 43-明显地改变头孢菌素在SephadexG-10中的色谱行为。 中国药典2010版最常用的流动相A是0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠和磷酸二氢钠 61:39),浓度常为0.1、0.01mol/L以及其他浓度,另外也有选用柠檬酸盐、硫酸铵或磷酸盐作为流动相。

流动相B的选择 流动相B常常采用纯水,或者0.01% 十二烷基硫酸钠,0.5% 的葡萄糖溶液也常被作为缔合峰测定的基本洗脱液。 在此条件下, β-内酰胺抗生素可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,从而表现出与高分子杂质相似的性质,可以作为自身对照溶液的洗脱条件。不过注意温度和时间的影响,需现配现用。实验中发现当对照溶液配制过久,出现的峰形容易拖尾,有可能是缔合峰随时间的增加解离的结果。

2.流动相A pH的选择 流动相的pH 对溶质的保留行为也有影响,通常情况下,pH 和K av间基本呈线性关系。碱性和偏碱性及酸性条件下头孢菌素极易发生聚合反应,其测得的高分子聚合物难以反映样品本身的实际含量。一般采用pH7.0,有的也采用 pH8.0或者 pH6.0。主要通过实验来确定。

3.流速的选择 4.温度的影响 中国药典2010版测定高分子杂质常用的流速有1.5、1.0、0.8ml/min等, 样品中高聚物的含量较低, 高分子杂质对温度比较敏感。为保证检测的准确度和重复性,实验中应注意控制温度,且样品处理后必须立即进样,避免其他因素干扰杂质测定的真性。

系统适应性实验 用蓝色葡聚糖2000做系统适用性试验,其保留时间与柱效及拖尾因子等参数共同代表着色谱柱的性能。在2010年版药典二部各品种高分子聚合物测定方法项下的系统适用性实验中,规定在两种流动相系中蓝色葡聚糖2000的保留时间(tRA,tRB)比值应在0.93~1.07之间;对照品测定的保留时间(t ’),供试品溶液中高分子聚合物的保留时间(t ”)与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000 的保留时间(tRA,tRB)比值应为0.93~1.07 。

另外,分别以流动相A、B为流动相,取0. 1mg/ml的蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于700,拖尾因子均应小于2 另外,分别以流动相A、B为流动相,取0.1mg/ml的蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于700,拖尾因子均应小于2.0。另外,以流动相B为流动相,精密量取对照溶液200µl,连续进样5次,峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%。

第六节 抗生素药物体内药物分析应用示例 HPLC法和微生物法 如:人血中头孢克洛的测定

练习与思考 [A型题] 青霉素钠、青霉素钾的鉴别方法是 A.三氯化铁反应 B. 硫色素反应 C. 焰色反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应 E. 双缩脲反应

头孢哌酮、哌拉西林的鉴别方法是 A.麦芽酚反应 B. 羟肟酸铁反应 C. 焰色反应 D.N-甲基葡萄糖胺反应 E. 坂口反应

《中国药典》规定组分测定的药物是 A.链霉素 B.青霉素 C. 庆大霉素 D.四环素

《中国药典》规定庆大霉素C组分测定为 A.离子对色谱法 B.电化学检测器测定 C. 蒸发光散射检测器测定 D.紫外分光法 E.微生物检定法

可以用麦芽酚反应加以鉴别的药物是 A.链霉素 B.青霉素 C. 庆大霉素 D.四环素

可以用坂口反应加以鉴别的药物是 A.四环素 B.头孢氨苄 C. 庆大霉素 D. 链霉素

[X型题] 1. 盐酸四环素需要检查的杂质有: A.差向四环素 B. 脱水四环素 C. 维生素C D. 金霉素 E. 差向脱水四环素

2. 青霉素水解产物有 A.青霉胺 B. 青霉醛 C. CO2 D. 派那地酸衍生物 E. 派那马地酸衍生物

[B型题] A。焰色反应 B. 硫色素反应 C.硝酸反应 D. 三氯化锑反应 E. 麦芽酚和坂口反应 1.青霉素钠 2. 硫酸链霉素