基因工程 Genetic Engineering

What is Genetic Engineering The formation of new combinations of heritable material by the insertion of nucleic acid molecules, produced by whatever means outside the cell， into any virus, bacterial plasmid or other vector system so as to allow their incorporation into a host organism in which they do not naturally occur but in which they are capable of continued propagation.

本课程的性质和任务 基因工程以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学技术为手段建立起来的应用学科，也为细胞工程、发酵工程、酶工程等课程提供理论和技术基础，是生物技术专业本科生必修的主干和核心课程。

本课程的地位： 生命科学 基因工程 生物工程 分子生物学

《基因工程》学习要求 要求认真做好每次课前的预习，并写出每章的课程预习总结。 认真做好每次课的笔记。 课后善于归纳和总结，及时消化、温故知新，记忆与理解相互促进。 认真完成布置的作业和思考题。 充分利用网络资源，拓展自己的知识面。 充分利用各种沟通渠道，师生互动式学习。

推荐阅读参考书： 基因工程，刘祥林等主编，科学出版社 基因工程，楼士林等编著，科学出版社 Gene cloning, T.A. Brown. Third edition. 基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社 基因的分子生物学，J.D.沃森等编，科学出版社5rd Gene VIII Benjamin Lewin Oxford Uni. 2004 《Gene VII》Benjamin Lewin Oxford Uni. 2000 分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社

Web： http://www.bioon.com/生物谷 http://www.biooo.com/中国生物论坛 http://emuch.net/bbs/小木虫 http://www.sciencenet.cn/科学网 http://www.ebiotrade.com/生物通

参考期刊 ①Gene ②Microbiology and Molecular Biology Reviews ③生物工程学报 ④中国生物工程杂志 ⑤中国生物化学与分子生物学杂志 ⑥生物化学与生物物理研究进展

学习内容 基因工程概论 基因工程的基础知识与基本技术 基因操作的工具酶 基因克隆的载体 目的基因的获取 DNA分子克隆 克隆基因的表达 转基因生物技术简介 基因工程操作程序

Chapter I 基因工程概论 基本概念和理论 基因工程的诞生及其发展 基因工程的研究内容及其应用 基因工程的安全性问题

一、基本概念和理论 （一）基本概念 1、重组DNA技术（recombinant DNA technique）

2、基因工程（gene engineering）：按照预先设计好的蓝图，利用重组DNA技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，能够持续稳定地繁殖与表达，从而实现受体生物的定向改造与改良。 基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。包括 上游技术和下游技术。 上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（DNA重组技术） 下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。

基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应 用。包括上游技术和下游技术。 上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（DNA重组技术） 下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。

一、基因工程的准备阶段 （二）基因工程的诞生发展史 理论基础 1、DNA是遗传物质 1944，Avery证明了生物的遗传物质是DNA（基因 工程的先导） （1）肺炎双球菌转化实验 （2）噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。

1957,Crick提出了遗传信息传递的“中心法则” 2. DNA双螺旋结构 1953年，Watson和Crick发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代 。 3. 中心法则和遗传密码 1957,Crick提出了遗传信息传递的“中心法则” DNA RNA protein 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana 等终于破译了64个遗传密码。

（1） 限制性内切酶（restriction enzymes）和 基因工程诞生的技术突破 （1） 限制性内切酶（restriction enzymes）和 DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 （标志着DNA重组时代的开始）

1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。 （2） 载体（vector） 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。 （3） 感受态体系 1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳 DNA测序技术

二、基因工程的诞生 1、Berg的开创性实验 1980年Nobel化学奖 1972年，美国，斯坦福大学，Berg等首次实现了DNA体外重组 SV40 λ噬菌体 DNA Ligase EcoR I 杂合DNA分子 1980年Nobel化学奖

2. Boyer-Cohen实验 标志着基因工程的诞生。 1973年，S. Cohen将含卡那霉素抗性基因的E. coli R6-5质粒与含四环素抗性基因的质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 标志着基因工程的诞生。

（三）、基因工程的迅速发展 1977年，E. coli中合成了人生长激素基因. （Genentech) －Genetic Engineering Technology 1978-1979，胰岛素基因在大肠杆菌中表达 1982年，培育出了超级鼠 1982年，第一个由基因工程菌生产的药物—胰岛素，在美国由Eli Lilly公司投向市场 1983年，获得第一例转基因植物-烟草（抗除草剂）1986年获得释放.

转大鼠生长素基因的小鼠

1990年，Perlak 将Bt基因导入棉花获得抗虫棉 （Bt基因：苏云金芽胞杆菌的杀虫蛋白基因。） 1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩德茜尔瓦接受了基因疗法（缺乏腺苷脱氨酶（ADA），体内腺苷累积过多，毒害淋巴细胞，并因此患上了先天免疫缺陷综合征。） 1991年，美国开始人类基因组计划；2001年完成。 1994年，基因工程西红柿在美国上市. 1997年，“多利”绵羊诞生

Dolly 震惊世界的20世纪重大的科技成果之一。

1999年 记忆力和学习力

山东首例克隆动物 2004山东首例有自主知识产权的克隆动物 －克隆山羊“白雪”

2006年东北农业大学 转基因猪，这是中国培育出的首例绿色荧光的转基因猪。

三、基因工程研究内容及应用 （一）基本过程：(切、接、转、增、检） 1.获得目的基因 2.目的基因和 载体体外重组 3.将重组DNA 分子转移到受体 细胞并增殖

4.筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞 5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞进行功能表达。 四大要素：目的基因、工具酶、载体、受体

（二）基础研究: 1、基因工程克隆载体的研究 如：质粒、病毒、噬菌体等。 2、基因工程受体系统的研究： 大肠杆菌、蓝细菌、酵母菌、植物愈伤组织、植物细胞、动物生殖细胞或胚细胞等。 3、目的基因研究：与医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因、编码具有特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。 4、工具酶的研究 5、新技术研究：转化技术、探针技术、PCR技术

（三）应用研究： (1) 基因工程与农业 ●转基因植物 ●抗病毒、抗真菌、细菌 、抗虫、抗除草剂、 抗逆境、改善植物品质。 ●转基因动物 (1) 基因工程与农业 ●转基因植物 ●抗病毒、抗真菌、细菌 、抗虫、抗除草剂、 抗逆境、改善植物品质。 ●转基因动物 鱼、牛、羊等。 基因工程：“超级生菜”将酸变甜

改善牛奶的品质，提高酪蛋白含量 转入生长素基因提高奶产量 获得人的凝血酶原激活 剂、凝血因子、尿激酶 等；改变羊毛颜色

(3)研制疫苗 (4)基因工程在工业、环境保护中的应用 (2)用转基因植物或动物生产药物 大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、 干扰素等 (3)研制疫苗 制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS） 中国农科院口服疫苗：抗乙肝番茄用于药物生产 胡萝卜：海带、 马铃薯 (4)基因工程在工业、环境保护中的应用

世界各国转基因作物大田释放情况 转基因作物特性 批准项数 所占比例 抗除草剂 1297 29.6% 抗虫 1046 23.8% 抗病毒 436 9.9% 农学性状好 211 4.8% 抗真菌 208 4.7% 其它 303 6.9%

中国已经批准进入大田的转基因植物 转基因植物 特性 申请单位 获批准数 马铃薯 抗病毒 中科院 4 抗病 中国农科院 1 抗逆 北京大学 高营养品质 水稻 抗虫 2 农科院 抗除草剂 水稻所

棉花 抗虫 中科院 农科院 美国孟山都公司 9 玉米 抗虫、除草剂 美国孟山都公司等 3 大豆 抗除草剂 1 小麦 北京农林科学院 高营养品质 番茄 抗病 北京大学 耐储存 华中农大 甜椒

辣椒 抗病毒 中科院 1 烟草 北京大学 2 抗虫 番木瓜 中国热带作物 广藿香 抗病 农业科学学院 矮牵牛 改变花色 杨树 微生物 提高固氮效率 农科院 华中农大 广东微生物所 6

（四）基因工程技术的意义 ●基因工程技术跨越生物种属间不可逾越鸿沟 ●基因工程技术缩短了进化时间 ●基因工程技术能对生物进行定向改造，设计构建新物种。 ●基因工程技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制,拓宽了分子生物学的研究领域 ●搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息 ●大规模的生产生物分子

四、基因工程的安全性问题 一、基因工程的安全隐患 1. 对环境的影响 2. 标记基因的危害 重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。 2. 标记基因的危害 制造带有抗生素抗性基因或除草剂基因有可能在生物体内传播。

3. 癌症扩散 4. 人造生物扩散 将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。

支持的声音 2000年1月24日：联合国生物多样性公约秘书处发起生物安全问题国际会议在加拿大蒙特利尔市开幕，600多名转基因技术专家发表联合声明，支持转基因技术。 与杂交技术与其他传统育种技术相比，基因工程在将遗传材料转入一种植物时具有更大的精确性。

二、基因工程实验室防护措施 1.物理安全防护措施：分4级：P1-P4 P1：一般装备良好的普通微生物实验室 压安全操作柜 P3：全负压实验室，同时装备安全 操作柜。 P4：专用的实验大楼，周围与其他 建筑物应有隔离带。最高安全防护 措施实验室

2.实验室的生物安全 ① EK1级的大肠杆菌 在自然环境中一般都要死亡。 ② EK2-EK3级大肠杆菌 在自然环境中无法存活。 目前常用克隆菌株JM109、DH5α等。