实验六 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
back 菌落特征 大多数酵母菌在适宜培养上形成的菌落与细菌的相似 1. 菌落表面湿润、粘稠、易被挑起。 2. 宏观上：较大，较厚，外观较稠，较不透明 3. 其色多为乳白，少数呈红色，如红酵母、掷孢酵母等。 ----- 菌落的颜色、光泽、质地、表面和边缘特征，均为酵母菌菌种鉴定的依据。 back
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大,其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
Mycelial development and chemical alteration of Candida Albicans from biotin insufficiency. Left: optimal biotin=yeast cell growth, Right: sub-optimal levels of biotin=systemic candida growth
Scanning electron micrograph of the common baker's and brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae. Note the budding division and previous bud scars.
酵母菌的图片
酵母菌的图片
酵母菌的图片
Sexual spores Ascospore----formed in a sac (ascus)
学习并掌握酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别方法。 一 教学要求 学习并掌握酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别方法。
二 实验原理 美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。
美蓝染色液 还原剂 美蓝（氧化型） 蓝色 美蓝（还原型） 无色 氧化剂
死活细胞鉴别原理 酵母活细胞 新陈代谢 还原能力 美蓝（还原型） 无色 美蓝（氧化型） 蓝色
酵母菌为嗜酸性菌,一般生长于酸性环境，在pH值为4. 5-5 酵母菌为嗜酸性菌,一般生长于酸性环境，在pH值为4.5-5.5间生长速率最高，而其生长下限pH为2-3，上限pH为7-8。实验所选用的美蓝溶液为吕氏碱性美蓝染色液，其水溶液为碱性，pH一定是超过7。当酵母菌处在吕氏碱性美蓝溶液中时，所处环境不利其生长，细胞内酶及核酸等的生物活性受抑，细胞内生物合成 活动也受抑。再加上美蓝溶液的渗透压会给细胞带来存活压力，尤其是水分子和一些离子在细胞内外渐渐趋于平衡，超过了酵母细胞所能忍受的极限。因此，染液浓度越高（0.1％> 0.05%）,则酵母菌活性受抑越严重，死亡率也越高。
活的酵母菌之所以无色，是因为不断地通过氧化还原反应，将氧化型的蓝色染液还原成无色的还原型，在这过程要大量消耗能量。而酵母菌在碱性环境下活性受抑，而染液中无法给酵母菌提供能源物质，加上还原过程是持续不断的。本身美蓝并不是培养基，细胞长期处于其中，营养跟不上，也容易渐渐死亡。因此，时间越久，酵母菌耗能就越多，死亡率也就越高。
三 材料与器材 菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 培养基和试剂： 马铃薯琼脂培养基; 三 材料与器材 菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 培养基和试剂： 马铃薯琼脂培养基; 0.05% 和0.1% 吕氏碱性美蓝染色液; 革兰氏染色用水-碘液. 显微镜，玻片、接种环、镊子等.
操作步骤 1、菌种活化 将酵母移种至新鲜的马铃薯琼脂斜面上，25~28℃培养48 h左右备用。 2、美蓝镜片的观察 1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。 2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。 5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 3、水一碘液镜片的观察 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
五 注意事项 1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。 2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
六 思考题 1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。 六 思考题 1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。 2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？