实验十七 谷丙转氨酶活性测定 Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
一、实验原理 氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机体内的酶，其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的种类甚多。 任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它们的最适pH接近7.4。
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）活力最强。 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内，在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。它们的催化反应如下：
COOH COOH COOH COOH CHNH2+ C=O C=O + CHNH2 CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2 COOH COOH 转氨酶←→ 丙氨酸 α-酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸
→ 本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。 测定转氨酶活力的方法很多，如分光光度法，纸上层析法等。在本方法中，谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α－酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2,4－ 二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4－ 二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。 →
二、实验用品 新鲜动物肝匀浆。 2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4） 1、材料 新鲜动物肝匀浆。 2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4） 取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml，再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）： 取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液内（宜当日新配）。
（3）谷丙转氨酶底物： 取分析纯α－酮戊二酸29.2mg，DL—丙氨酸1.79g置于小烧杯内，加1N NaOH约10ml至完全溶解。用1N NaOH或1N HCl校正其pH=7.4，加0.1M磷酸缓冲液稀释至100ml，然后加氯仿数滴防腐，在冰箱内可保存一周。此溶液每1.0ml含α－ 酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸200微克分子。 （4）2，4—二硝基苯肼溶液： 将A·R纯2，4—二硝基苯肼19.8mg加入200ml锥形瓶内，加100ml 1N HCl液。2，4—二硝基苯肼溶解较慢，把锥形瓶放在暗处不时摇动，全部溶解后，滤入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。 （5）0.4N氢氧化钠液。 3、仪器设备 试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
三、方法和步骤 1、肝匀浆制备： 取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
2、标准曲线的绘制 取6支试管分别用0、1、2、3、5标号，按下表所列次序添加各试剂。 将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保温20分钟， 最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升， 在室温下静置30分钟后， 以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制 管号 试 剂 1 2 3 4 5 丙酮酸钠标准液/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 1 2 3 4 5 丙酮酸钠标准液/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶底物/ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 磷酸缓冲溶液 (0.1M pH7.4) /ml 37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度 2，4-二硝基苯肼/ ml 保温20 分钟 NaOH (0.4N)/ml 静置30 A520nm
2、谷丙转氨酶酶活力的测定 表2.谷丙转氨酶酶活力的测定 1 测定管 2 “空白”对照管 谷丙转氨酶底物/ml 0.50 2 “空白”对照管 谷丙转氨酶底物/ml 0.50 37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡 稀释肝匀浆/ml 0.10 37℃水浴保温30分钟 2,4—二硝基苯肼试剂/ml 保温20分钟，冷却 NaOH (0.4N) /ml 5.0 室温下静置30分钟 A520nm
四、实验结果 用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位数，计算 每100毫升稀释肝匀浆中转氨酶的活力单位数
五、思考题 1.谷丙转氨酶活性测定的原理是什么? 2.在“空白”对照管中为什么也要加入肝匀浆?
六.参考文献 1.现代生物学基础实验指导,林宏辉等,四川大学出版社,2003 2.生物化学实验,陈钧辉等编,3版或4版 科学出版社2003