中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科 抗ENA抗体检测及临床应用 中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科

☆ 半个世纪以来自身抗体的发现和检 测,推动了自身免疫性疾病的诊断和 治疗。

自身免疫病相关自身抗体的产生 人体免疫机制出现异常 自身成分 　　　　　　作为异体抗原 T细胞 巨噬细胞 MHC Ｔ细胞诱导　　　　Ｂ细胞产生自身抗体

☆ 自身免疫发生的机制、抗体在自身 免疫性疾病中的作用以及免疫耐受 的损害仍然 是研究的热点。

什么是自身抗体 ? 自身抗体的产生是易感者（易感基因）在环境因素（病毒等）诱导下对自身组织或成分异常的免疫反应。 什么是自身抗体 ? 自身抗体的产生是易感者（易感基因）在环境因素（病毒等）诱导下对自身组织或成分异常的免疫反应。 自身抗体是自身免疫性的标志。 自身抗体的产生是自身免疫反应，与自身免疫性疾病不同义，它早于疾病产生。

自身抗体的临床意义 自身免疫的生物标记 预示自身免疫病 早期诊断和分类弥漫性结缔组织病 指示疾病活动性、预后

自身抗体是自身免疫性风湿病（ARD） 的生物标记（Bio-marker） 结缔组织病 ANA 干燥综合症 SSA/SSBab SSAab M3Rab 肌炎/皮肤炎 Jo-lab Mi-2ab SRPab （合成酶抗体） 系统性硬化病 Scl-70ab ACA 核仁型ANA 系统性血管炎 ANCA-PR3 ANCA-MPO ENCA （内皮细胞抗体） 原发性胆汁性 AMA AMA-M2ab 核包膜ab 肝硬变

抗核抗体谱（ANAs）分类 抗DNA抗体（anti-dsDNA，anti-ssDNA ） 抗组蛋白抗体（histons: H1 , H2A , H2B , H3 , H4 , H2A-H2B复合物） 抗ENA抗体（抗体: Sm , nRNP , SSA/Ro , SSB/La, rRNP , Scl-70 , Jo-1 , PCNA , RA33 , ANAs 抗非组蛋白抗体 Ku,RANA,Mi-1,Mi-2,PL-7,PL-12.） 抗着丝点抗体（ anti-CENP -A , B , C ，D，F，G） 抗核仁抗体（抗体: RNA-polymerase-1 , PM-Scl/PM-1，Th/To, U3nRNP/Fibrillaria，4-6-S-RNA） 抗其他细胞成分抗体（高尔基体，中心体，纺锤体，线粒体，溶酶体， 肌动蛋白，Vimentin，细胞角蛋白，Lamin)

抗可提取性核抗原（ENA）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodies 应用最多 、最特异的一族抗体。

可提取性核抗原（ENA） extractable nuclear antigen 蛋白可以用盐水进行提取，因此称为 可提取性核抗原。 成分：核酸与核蛋白，不含DNA，组蛋白。 功能：参与细胞内DNA的复制、转录以及蛋白的翻 译合成

可提取性核抗原（ENA） extractable nuclear antigen 属间差异，但有明显的组织不均一性。 理化特性：ENA抗原对温度和RNA酶敏感。

抗ENA抗体检测方法 对流免疫电泳法( CIE) 免疫双扩散法(ID or DID) 免疫印迹法(IB) 酶联免疫吸附法(ELISA) 蛋白芯片（Protein chip）

对流免疫电泳(CIE)结果判断

免疫双扩散(ID)检测结果判断 上图为抗Sm、U1-RNP抗体阳性滴度均为1:4 下图为抗SSA、SSB抗体阳性 抗SSA抗体滴度1:64 抗SSB抗体滴度1:16

＊ 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%- 30%）。 可早于疾病1—2 年出现，是前瞻及回顾性诊 断的指标。 ＊ Sm 抗原决定族主要在与U1,U2,U4--u6RNA 连接的B和D 蛋白多肽上，分子量： （29KD），B’（28KD),D (13.5KD)。

→ rRNP sm ← → rRNP sm ←

＊ Sm和U1RNP是同一分子复合物中的不同 ＊ SmAb和rRNPAb常同时检出，同为SLE 标记性抗体。

在,高滴度有利于MCTD的诊断。 在AID中阳性率40%-- 60%。 抗原表位分子量: 73 KD 、32 KD 、 ＊ 抗U1RNP抗体在多种结缔组织病中存 在,高滴度有利于MCTD的诊断。 在AID中阳性率40%-- 60%。 抗原表位分子量: 73 KD 、32 KD 、 17.5 KD 、28/29 KD。

＊ 文献报告U1RNP和Sm的B B’有共同的 氨基酸序列， 不但Sm Ab和B B’ C末 端富含脯氨酸的区域结合，这个区域在 其他的小核核蛋白尤其是 U1RNP中都 存在，所以它不止是SmAb识别的抗原 表位，也是U1RNP重要的抗原表位。

RNP RNP sm RNP RNP

Sm U1RNP N= 2096 BB’ 28/29KD 69.9% ID法与U1RNP抗体符合率=74.4% ID法不支持抗Sm抗体

sm u1Rnp ↓ CO sm ↓ ↓

＊ 抗U1RNP抗体在IBT检测中最具多态性 ， 与上述4 个抗原表位可有不同排列组合的 连接。说明其在自身免疫中是多克隆、 多位点的。在不同的病人中存在着显著地 异质性 。

＊ 有文献报告：用ELISA法为健康人检测抗 SSA 抗体，阳性率17%。在抗SSA抗体阳性的系统性 抗体,阳性率大约 ： 6 0 -75% 。 两个抗原表位，分子量 52KD, 60KD。 ＊ 有文献报告：用ELISA法为健康人检测抗 SSA 抗体，阳性率17%。在抗SSA抗体阳性的系统性 红斑狼疮和干燥综合征病人的一级亲属中用同法 检测, 阳性率达25%。

＊ 抗SSA 抗体在SLE和SS中最多见，常常和光过敏、 血管炎、血小板减少、紫癜等有关。ANA阴性的 ScLE常常有抗SSA 抗体。 ＊ 抗SSA 、SSB抗体可造成新生儿狼疮，婴儿心脏传 导阻滞等先天性心脏病。 ＊ 抗SSB抗体： AID 10 -40%，在PSS,SLE中多见。 分子量45KD、47KD、48KD,在各种检测方法中与 抗 SSA抗体伴随出现。

→ SSA → RO → SSB

CO ↓ ↑ ↑ ssB Ro52 ssA

结构，它的天然构象是SSA抗原性的保证。52KD SSA抗原不依赖这种空间结构，它的Ｃ末端可非特 异的和血清中的蛋白连接而形成线性的表位，因此 特异性较差。

＊ 抗Scl-70抗体：SSc中 25 -75%, 标记性抗体。 10倍。 ＊ 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体。在合并 肺间质变的PM/DM病人中抗Jo-1抗体阳性率高达 60%。 ＊ 抗rRNP抗体： SLE特异性抗体（10%-30%） 抗rRNP抗体与dsDNA、与SSA/RO、ACL相关。 滴度升高仅限于SLE,其他疾病很少见。

 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%）  抗U1RNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗可提取性核抗原（ENA）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodies  抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%）  抗U1RNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度）  抗SSA抗体： CTD 6 0 -75%  抗SSB抗体： CTD 10 -40%，PSS,SLE  抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体  抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体  抗rRNP抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）

抗ENA抗体检测方法 对流免疫电泳法( CIE) 免疫双扩散法(ID or DID) 免疫印迹法(IB) 酶联免疫吸附法(ELISA) 蛋白芯片（Protein chip）

ENA抗体谱芯片 - Luminex技术 美国FDA批准的Zeus 和INOVA ENA抗体谱芯片都是采用Luminex技术，又称液态芯片。它是基于流式细胞仪计数原理，不同荧光编码的微球体上交联了不同的靶抗原并以一定数量混合，加入血清样本后，血清中的各自身抗体就会被所对应的微球体捕获。然后，在Luminex检测仪上，这些荧光编码的微球体被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球体的荧光编码从而决定被测自身抗体的种类；另一束测定微球体上荧光强度从而给出被测自身抗体的含量。    

BioPlex 2200

Plate-Based Multiplex Assay System Array－ELISA Plate-Based Multiplex Assay System Array－ELISA技术利用生物芯片技术的并行检测能力，结合抗原与其相应抗体特异性结合的免疫学原理，将传统的ELISA诊断方法缩微化，把不同自身抗体针对的靶抗原点阵于经特殊化学处理的96孔内，捕捉被检者血清中的对应抗体，通过特定的化学发光反应产生光信号，根据光信号强度对自身免疫抗体进行半定量检测。 一份样本一次反应就能同时检测多项指标，多项检测指标以pannel 的形式进行检测，可降低检测成本，提高检测速度。

Array ELISA Array－ELISA Array/chip，包括核酸芯片、蛋白芯片和组织芯片，它具有高通量、快速、微量化、并行化的特点； Array－ELISA技术利用生物芯片技术的并行检测能力，结合抗原与其相应抗体特异性结合的免疫学原理，在96孔ELISA板上结合抗原或特异性抗体，捕捉被检者血清中的对应抗体或抗原，通过特定的化学发光反应产生光信号，根据光信号强度进行定性或定量检测。 一份样本一次反应就能同时检测多项指标，多项检测指标以pannel 的形式进行检测，可降低检测成本，提高检测速度。 Array－ELISA

ENA抗体检测结果( Array-ELISA) Sm RNP SS-A SS-B Scl-70 Jo-1 + - Image

自身抗体预示着自身免疫风湿性疾病（ARD） 易感性 若干年 自身抗体（+）若干时间 （基因） 无症状 环境 环境 自身抗体先于ARD出现。虽无临床症状，但 有自身抗体出现，并以具有很长潜伏期为特征。自身 抗体具有可以预测疾病的作用。 ARD症状

总结 自身抗体是自身免疫病的标记 自身抗体出现在自身免疫风湿病（ARD）之前 自身抗体参与疾病的发生与发展 自身抗体提供临床诊断、疾病活动性及预后、脏器损伤、药物疗效的信息 新的自身抗体仍在出现，可能提供指导更多的临床诊治

Thank you