分子标记技术及其 在植物中的应用 周军 教授

一、分子标记概述

标记 ：标志，记号。 遗传标记：具有遗传特性的标记。

遗传标记：基因型的特殊的易于识别的表现形式。其最基本的两个特性是： 　可遗传性。 　可识别性（多态性）。 遗传标记是研究遗传现象和物种进化的不可缺少的工具。

遗传标记的主要种类 狭义上，仅指以DNA为基础的分子标记。 广义上，还包括同工酶（等位酶）。 形态学标记； 细胞学标记； 生化标记； 分子标记（建立在某些大分子物质多态性基础上的一类遗传标记）。 狭义上，仅指以DNA为基础的分子标记。 广义上，还包括同工酶（等位酶）。

DNA分子标记： 　　　是一种小的DNA片段，其分子量通常只有几十～ 几千bp（碱基对），相对于庞大的基因组（几亿～ 几十亿bp ）而言，实在是很微小（小有小的好处）。 　　　多数情况下， DNA分子标记并不是基因或基因的一部分，而是与基因有连锁关系的一个小片段。 　　　是否具有两个基本特性： 　　　可遗传性； 　　　可识别性（有难度，需要较高的技术）。

改善可识别性的思路与方法： 提高检测技术的灵敏度（同位素，EB染色、银染等）； 加大DNA 的绝对量（PCR扩增，大量提取）； 上述两者结合使用。

DNA分子标记的优点： 　位点数目相当多，基本上能满足研究之需； 　直接检测DNA，无需等待基因的表达，也不　受环境条件的影响； 　多为中性突变（因为它一般不属于基因）； 　多为共显性遗传。

常用的DNA分子标记种类： RFLP（限制性片段长度多态性）：利用限制性内切酶对核苷酸序列的识别作用，将基因组DNA切割成不同长度的片段，通过电泳分离、分子杂交及显影技术（同位素或非同位素），把材料间DNA的差异揭示出来。 　材料间DNA的差异，来自于限制性酶切位点的变异（增加或减少），使切割产物（片段）的长度发生变化（变短或变长），最终产生多态性。 　技术关键：所用的限制性内切酶能否恰好识别特定的位点（变异位点）。

模板酶切前 模板酶切后

分子杂交及放射性自显影之后出现的多态性

　　　RFLP可转化为次级标记，如酶切扩增多态性序列(CAPS)或序列标记位点（STS），是指将能产生多态性的RFLP探针的两端测序，合成引物对基因组进行扩增，扩增产物为基因组中与探针同源的DNA片段，由于这样的扩增片段一般较少表现多态性，还需要用多种内切酶酶切扩增产物，以期获得扩增片段内存在的多态性。由于只有扩增片段长度内（即探针片段长度内）存在的多态性才有可能被检测到，这种方法所检测的的多态性水平较低。

ALP（扩增子长度多态性） 　　　RAPD(随机扩增多态性DNA)，AP-PCR(随机引物PCR扩增)和DAF(DNA扩增指纹分析)相似，都是以随机引物PCR扩增为基础，它们合称为ALP。 　　　RAPD和AP-PCR分别由Williams等（1990）及Welsh等（1990）于1990年提出，被分别用于遗传作图和基因组指纹分析。但两者其实是类似的方法。与一般的PCR扩增相比，RAPD和AP-PCR采用随机设计的单个引物，常用的引物为10个核苷酸的DNA序列，扩增时退火温度降低至35℃左右，以利于引物与模板结合。 　　　DAF则是由Caetano-Annoles等人（1991）于1991年建立的，所用的引物更短（5-8个核苷酸），扩增产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染观察，DAF可产生更多的DNA扩增片段，单个反应能获得较多的信息。这三种标记都呈显性遗传。

RAPD电泳谱带 模板DNA

　　　　引物的结合位点数目多少及其在基因组中的分布情况，是RAPD分析的关键所在。RAPD分析的最佳片段大小为400～2000bp。 　　　RAPD标记也可转化为次级标记，称为序列特异性扩增区（SCAR），是指在RAPD分析中获得多态性DNA片段以后，对其两端测序，根据所测DNA序列，重新设计双引物进行特异PCR扩增，用以提高检测的可靠性和稳定性。SCAR在不同个体之间可能表现为存在／缺失，为显性标记，也可能表现为扩增片段长度的差异，为共显性标记。

AFLP(扩增片段长度多态性) 　　　AFLP是RFLP和RAPD两项技术的结合，它是荷兰科学家Zabeau和Vos（1993）发明的一种标记技术，已在美国申请了专利。先将DNA用限制性内切酶降解，然后连上一个接头，根据接头和酶切位点的核苷酸序列设计引物，即：引物＝接头＋酶切位点＋2～3个选择性核苷酸，对基因组限制性酶切片段进行选择性PCR扩增。AFLP标记所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段内DNA序列的插入或缺失，本质上与RFLP技术相同，但操作简单得多。

模板DNA AFLP指纹图

　　　AFLP分析的最佳片段大小为200～500bp。 　　 选择性核苷酸数目一般为3个，能够检测限制性片段总数的1/4076。

SSR（简单重复序列） 　　　也称微卫星或短串联重复序列多态性（STRP）。它是基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复，由于重复次数的不同而产生DNA片段长度的多态性。其检测采用PCR扩增。与RFLP相比，微卫星DNA在基因组中非常丰富，分布也比较均匀，多态性水平高，是一种较理想的分子标记，但该类标记的物种特异性强，工作量大，费用高。

SSR

其它： SNP（单核苷酸多态性）：单核苷酸的变异广泛存在，可通过特别的方法进行检测（测序或荧光法）。 SSCP（单链构型多态性）：对RFLP标记设计引物进行PCR扩增，热变性成单链再复性，由于单链内核苷酸顺序的差异，有的可复性为双链，有的则形成链内氢健，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。 RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism)。 SRAP, STMS, ESTP, CAPS, RGHP, SAMPL, MITES等。

二、分子标记的应用

用分子标记鉴别果树品种具有十分重要的意义。 品种鉴别 　　　用分子标记鉴别果树品种具有十分重要的意义。 　　　虽然报道的果树品种数量很多（如葡萄为14000个以上），但其中可能存在不少同物异名或同名异物情况，需要纠正。利用分子标记鉴别同物异名的情况最为有效，因为它不受环境条件的影响。 　　　其次，在众多的果树无性系中，系间尤其是芽变系品种间的差异往往不是十分明显，给品种区分带来困难。通过分子标记辨别就相对容易，因为分子标记的长处，就是能检测遗传物质的细微差异。 　　　目前用DNA标记进行品种鉴别或分类研究的果树种有苹果、梨、桃、柑橘、葡萄、草莓、油橄榄、番荔枝、番木瓜、芒果、悬钩子、乌饭树、酸果蔓及桑树等，涉及的分子标记种类也相当齐全。

同物异名品种鉴别

芽变品系鉴别

遗传多样性检测与品种分类 　　DNA序列的改变，是导致生物演化的最基本的元素，因此，通过DNA分子标记研究，更能揭示个体间的差异及物种间的相关性，这些知识对利用野生种质资源改良栽培品种也十分有用。在果树上，这方面的研究已成为一个热点，涉及的树种非常之多。已证实宽皮柑橘类、果梅和油橄榄品种间具有高度的遗传多样性，而桃和草莓的却比较低。 　　遗传多样性水平的高低直接取决于样本的数量和来源地。 　　　利用数字分类学软件，可以很方便地进行聚类分析和分类研究，得到树状图。常用的软件有NTSYS-pc，Popgene（http://dendrome.ucdavis.edu/）和SAS（SAS Institute Inc）等，前两者的效果更好。

品种分类研究—RAPD分析

品种分类研究—树状图

　　　遗传多样性和聚类分析的结果，还能指导杂交亲本的选择选配工作，并可用于预测后代的杂种优势。

　系谱分析 　　　果树存在着大量的自然杂种类型，一些著名的栽培品种，最初也是由自然杂交籽苗繁衍而来，有些品种则是实生选种或采用混合花粉杂交选育而成的，其系谱关系很模糊。DNA分子标记为这一问题的解决提供了有力的工具。有关的研究已证明，柠檬可能起源于枸橼、温州蜜柑应起源于中国的本地早（而非日本立花橘），苹果上，两个三倍体品种品种“乔纳金”（金冠×红玉）和“陆奥”（金冠×印度），都是由母本金冠提供了未减数的配子，日本苹果品种“津轻”的父本为“红玉”，新西兰的主栽品种“Braeburn”的亲本为“Lady Hamilton”。 　　

父本系谱关系的鉴别

　 利用父本的显性标记鉴别父本系谱； 　　利用母本的显性标记或细胞质标记鉴别母本系谱。

树状图中的系谱关系

构建分子遗传图谱 　可为目标基因的定位及克隆奠定基础（图位克隆）； 　利用连锁关系，可对目标性状进行预选，预选工作可在幼苗期即完成； 　利用连锁关系，可进行基因聚合育种，定向地改良品种（不断加强某个经济性状）； 　对质量性状和数量性状都适用。

f m 分离位点的获得 M04

连锁图谱构建

连锁群之一

　　 目前，应用RAPD、RFLP及同工酶等标记，已构建了苹果、桃、扁桃、柑橘、葡萄、甜樱桃、尖苞片蕉（香蕉的原始种之一，为二倍体）、番木瓜、核桃和越橘（乌饭树）的分子连锁图，而其中单独应用RAPD标记或以RAPD标记为主进行图谱构建的树种就有柑橘、苹果、桃、葡萄、甜樱桃、二倍体蕉、番木瓜和越橘8个种类，所用的作图群体为F1、BC1、F2和花粉培养群体。加上荔枝，共有11种果树。

基因标记、定位与辅助选择 　　　在许多情况下，果树品种的改良，只需针对个别性状进行，因此，只要找到与目的基因紧密连锁的分子标记，即可用于早期选择。在这方面，Michelmore等（1991）建立的基于RAPD技术的集团分离分析法（BSA）提供了有力的工具，该方法的通常做法是，针对某一性状（如抗病性），将分离群体的单株分成两个集团（抗病集团和感病集团），对其进行DNA多态性分析（常用RAPD），寻找多态性片段。从理论上说，这两个集团的DNA应是基本一样的，如果其间的确存在DNA的差异，那么这种差异（即多态性DNA片段）就很可能与控制该性状（抗病性）的基因座位连锁，可以用于辅助选择。

Cheng 等在Rome Beauty x White Angle 的分离群体中进行研究,从350 个随机引物中选出一个引物BC226(5’GGGCCTCTAT3’) ,可在两个池(红色池和黄色池) 间扩增出不同的片段。在群体上的进一步试验发现有两个片段与红色性状相关,另外两个片段与黄色性状有关。设计合成一对通用引物来扩增这些片段,不同的扩增片段与果实颜色表现共分离, 片段A1(1160 bp) 与Rome Beauty、A2 (1180 bp) 与White Angle 的红色性状连锁,a1 (1230 bp) 与黄色性状相连锁。后代同时具有A1 和A2 或其中之一,则表现红色。在另外的3 个杂交组合中,A 与红色性状共分离,a1 和a2 (1320 bp) 与黄色性状相关。

　　集团分离分析在果树基因定位方面已被广泛应用，目前果树上已标记的基因包括抗性基因、经济性状基因以及QTL基因几个类别。如苹果抗黑星病Vf基因，柑橘抗柑橘衰退病（CTV）基因，苹果抗疫霉病基因，桃抗白粉病基因，葡萄抗黑痘病及抗霜霉病基因等。 　　　经济性状方面，已被标记并用于辅助选择的基因座位有苹果果皮颜色，桃的经济性状（8个质量性状），荔枝的成熟期、焦核性，葡萄的无籽性状、皮色及育性等。

杂种、体细胞杂种、突变体、珠心苗与合子苗的鉴定 根据父本的特征带可以鉴定其后代是否为真正的杂种，具有多方面的用途。 　　根据父本的特征带可以鉴定其后代是否为真正的杂种，具有多方面的用途。 　　分子标记对体细胞杂种的鉴别也非常有效，在柑橘类上有较多的成功经验。 　　突变体是基因组个别或少数位点发生突变的结果，由于一个引物仅能检测基因组的极小部分，因而突变体的检测比较困难，需采用大量的引物才可能获得成功。突变体的鉴别在樱桃、桃和荔枝上有成功的报道。

荔枝焦核突变体的鉴定

　　 其它方面，如鉴别苹果品种的芽变植株与实生苗植株，苹果属的显性矮化主基因、元帅系苹果的短枝型芽变，苹果的柱形株型基因，以及柑橘的合子苗与珠心苗等，都有成功的报道。

　　　由此看来，分子标记在物种起源与进化，品种分类与杂种鉴定等方面都有广阔的应用前景。另外，由于多种果树建立了分子连锁图谱，与目的基因紧密连锁的分子标记也被不断地鉴别出来，将能有力地促进果树品种的改良，可以预料，该技术将在果树遗传育种研究中将发挥更重要的作用。

四、小结（体会）

分子标记是一种有效的工具，但要善于掌握与利用。用得好，事半功倍，用不好，步入谬误。 分子标记技术应结合常规育种技术，才能有更强的生命力。 如果分子标记的研究结果与传统研究结果相矛盾，怎么办？ 研究工作中的严谨精神至关重要，必须克服模糊的东西，获取最可靠的数据。

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