DNA RNA Protein 8 蛋白质生物合成及加工 绪论 1 绪论 癌基因分子生物学 2 核酸的结构和性质 4 基因与基因组 5 癌基因分子生物学 2 核酸的结构和性质 DNA 4 基因与基因组 √ 3 DNA的复制 6 基因的转录 RNA 7 转录后加工 8 蛋白质生物合成及加工 Protein 9 基因表达调控 2017/4/8

第三章 DNA复制 (DNA Replication) 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

【主要内容】 4.1 DNA复制的基本概念 4.2 DNA复制的重要酶和蛋白质 4.3 DNA复制的特点 4.4 DNA半保留复制的机理 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

【学习目的与要求】 重点掌握： 1.DNA复制所需的一些重要酶 2.DNA复制中的一些基本概念 3.真核生物和原核生物DNA复制的主要区别 了解： 1.DNA复制的一般过程 2.DNA复制的几种方式 3.DNA突变的几种诱发因素 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.1 DNA复制的一些基本概念 (Basic Concept of DNA Replication) 遗传物质的基本属性：基因的自我复制 控制性状的表达 Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

遗传物质的分子机制 分子生物学的核心 DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每条单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTPs,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.1 DNA复制的一些基本概念 (Basic Concept of DNA Replication) 复制子（replicon）或复制单位（replication unit）：含有一个复制起点（ori或o，origin of replication），能够独立进行复制的DNA区段。 replicon :A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.1 DNA复制的一些基本概念 (Basic Concept of DNA Replication) 复制叉（replication fork）：复制开始时，起始点处的DNA双螺旋先松解开，松开的两股链和未松开的双螺旋形状象一把叉子，称为复制叉。 复制体（Replisome）：由延伸的复制叉和复制所需的蛋白质因子构成的动态复合物。 Replisome ：The multi protein (30±) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

复制子 复制叉 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.1 DNA复制的一些基本概念 (Basic Concept of DNA Replication) DNA的半保留复制（ Semi-Conservation Replication ）：两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。 前导链(leading strand) ：DNA双螺旋走向是5′→3′, 3′→5′方向，DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链，前进方向与复制叉打开方向是一致的。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.1 DNA复制的一些基本概念 (Basic Concept of DNA Replication) 后随链(lagging strand )：合成方向与复制叉解链方向相反，并且是不连续合成的子链,是以5′→3′为模板时，先合成多条5′→3′方向的短链，叫做随从链(lagging strand) 。 冈崎片断(Okazaki fragments) ：在DNA后随链的合成中先以片段的形式合成岗崎片段，多个岗崎片段再连接成完整的链。 半不连续复制(semi-discontinuousreplication)：前导链的合成是连续的，随从链的合成是不连续的，所以DNA的复制是半不连续复制。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.2 DNA复制的一些重要酶和蛋白质 ① 拓扑异构酶（ Topoisomerase）：主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。 DNA拓扑异构酶催化的反应很多，其反应本质是先切断DNA的磷酸二脂键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能．然而它们并不能连接事先已经存在的断裂DNA，也就是说，其断裂反应与连接反应是相互耦联的。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅠ），通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅡ）。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

②解链酶（Helicase）：DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。 故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

③单链结合蛋白（SSB）：使新解链的DNA保持稳定结构。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

④引物酶（Primases）：为DNA复制提供RNA引物。 ⑤DNA聚合酶（ polymerases）：合成新生DNA链，切除RNA引物。 ⑥DNA 连接酶（Ligases）：使新生DNA链上的缺口（3＇- OH，5′- p） 生成磷酸二酯键。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

解链酶（Helicase) 又称解螺（unwinding enzyme） 或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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拓扑异构酶（Topoisomerase） 定义：可使DNA拓扑异构体互变的酶，切割DNA链，使其松弛后再连接。 Ⅰ型拓扑异构酶：不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。 Ⅱ型拓扑异构酶：切割DNA双链，此时不需ATP；后后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

♦ 功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯 键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解 旋旋转改变DNA分子的拓扑结构。 参与复制、转录、重组。 ♦ 效应：可使DNA发生：连环化（catenate）、脱连环化 （decatenate）、打结（knot）、解结（unknot）。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

拓扑异构酶Ⅰ： MW＝100kD，单肽链，含3－4个Zn 作用： 每次改变一个连环数； 结合DNA，使该处溶解； 形成酶－DNA复合物； 切割双链中的一股，使DNA中的一股链穿越切割点； 断裂单链连接 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

拓扑异构酶Ⅰ作用机理示意图 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

拓扑异构酶Ⅱ：又称旋转酶。 广泛存在于各种生物中。 作用： 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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拓扑异构酶Ⅱ的作用机制 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。 真核生物拓扑异构酶： 酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。 Ⅰ型：MW＝95kD，单体蛋白，不需ATP； Ⅱ型：MW＝150－180kD，均为二聚体，需ATP和 Mg2+。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

单链DNA结合蛋白 原核：单链结合蛋白SSB 四聚体 真核：复制蛋白A（replication protein A , RPA) / replication factor A , RF-A 异源三聚体 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：① 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；② 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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原核生物DNA聚合酶 研究最清楚的是大肠杆菌中的DNA聚合酶，已鉴定了5种不同的DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。 DNA聚合酶I在半保留复制中起一个辅助的作用，涉及到修复被破坏的DNA。 DNA聚合酶II同样隐含有修复的作用。 DNA聚合酶III，一个多亚基的蛋白质，是负责全程合成新的DNA链的复制酶。 DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，涉及DNA的错误倾向复制。

a. DNA Pol Ⅰand its function 1955年，Kornberg 在E.Coli中发现DNA pol Ⅰ 。分子质量为10.3万道尔顿，单一肽链组成，多肽链中含一个Zn。DNA pol Ⅰ可被水解为一大一小两个片段。 1.结构 大片段：68000U，又称Klenow片段； 具有5’ →3’聚合酶活性和3’ → 5’外切酶活性（有校正功能）。 小片段：35000U，具有5’ →3’外切酶活性，切 除小片段DNA/RNA，如切除RNA引物。

Klenow片段的结构（右手形状） Thumb 拇指结构区 Fingers 指形结构区 Palm 掌形结构区 不仅是DNA pol I ，右手结构是所有核酸聚合酶的共同特征。 当模版链落入聚合酶右手拇指和食指结构间的凹槽时，引起酶分子构象改变，使其能握住核酸分子。 Palm 掌形结构区 Klenow片段的结构（右手形状）

2. Klenow片段的校正功能

Mispaired last base pair Exonuclease active site a. DNA合成速度减慢 Mispaired last base pair 然而仍不可避免的有碱基错配，，一旦出现碱基错配，聚合反应立即停止，错配的核苷酸的3‘-OH落入3’ → 5’外切核酸酶活性位点，错配核苷酸迅速被除去，然后聚合反应继续进行下去。 Exonuclease active site

b. 错配碱基的清除

c. 恢复DNA合成

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b. DNA PolΠ and its function 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

c. DNA pol Ⅲ and its function 1970-1971年，Korn.berg和Gefter先后分离出了DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅲ是由多个亚基组成的蛋白质，亚基很容易解离。全酶由10个亚基构成，含有Zn原子。

1. DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成 亚基 数目 基因 功能 α ε θ τ γ δ δ’ χ ψ β 2 1 4 ploC(dnaE) dnaQ(mutD) holE dnaX dnaX* holA holB holC holD dnaN 聚合酶活性 3’ →5’外切酶校对功能 核心酶 组建核心酶 核心酶二聚化 依赖DNA的ATP酶,形成γ复合物 可与β亚基结合，形成γ复合物 形成γ复合物 两个β形成滑动夹子提高酶持续合成能力 夹子装置器

(α,ε和θ) (2γ,δ,δ’,χ和ψ,夹子装置器) (βdimer,滑动夹子)

β亚基二聚体构成一个滑动的夹子，夹住DNA分子相对滑动，使聚合酶在完成复制前不脱离模板DNA而持续聚合。 β二聚体使得全酶的持续性非常高。β和DNA结合的很紧密，但是可以沿着双链分子滑动。β的晶体结构表明它形成了一个环状结构的二聚体。在图15.14的模型中表明了β环和DNA双链螺旋结构的关系。这个二聚体包围着双链，提供了一个“活动夹板”允许全酶沿着DNA滑动。这种结构解释了高持续性--因为酶无法脱落！ 

DNA pol Ⅲ复杂的亚基结构使它具有更高的保真性(fidelity)、协同性(cooperativity) 和持续性(processivity)。

2. The catalysis reaction 在反应中，dNTP上的α-磷原子亲核攻击RNA引物链(或具有有利3‘-OH的DNA链）的游离3’-OH,形成3’,5’-磷酸二酯键并脱下焦磷酸。聚合反应的能量来自α-与-β磷酸之间高能键的裂解。

以dNTP为底物，释放PPi获得能量 Mg 2+ 反应受模板指导 在链的3’-OH端延伸 延伸方向是5’ →3’ 新DNA与模版链互补

只有根据碱基互补原则配对的dNTP才会加到3’-OH末端， 聚合酶能辨别进入的底物核苷酸，是由于凹槽空间只允许底物与模版形成Waston-Crick类型的碱基配对。这是酶对底物专一性识别的过程。 DNA pol

DNA聚合酶Ⅲ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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DNA连接酶 DNA ligase + NAD+/ATP ↓ 酶-AMP复合物 ↓+DNA AMP-DNA 相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击 ↓→AMP 3’,5’-磷酸二酯键 大肠杆菌和T4连接酶具有相同的缝合具有3’-OH和5’-磷酸末端的切口的性质，如图15.7所示。这两种酶都会进行两步反应，会涉及到一个酶-AMP复合物。（大肠杆菌和T4的酶使用不同的辅因子。大肠杆菌的辅因子是NAD[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸]，而T4的辅因子是ATP。）酶复合物的AMP和切口的5’-磷酸端结合在一起；然后一个磷酸二脂键会在3’-OH端生成，并且释放酶和AMP。

Primase 引物合成酶 Primase又称为引发酶，E.Coli中基因dnaG的产物，是一种特殊的 RNA 聚合酶，以单链DNA为模板合成互补于DNA链的RNA引物，合成方向是5’ →3’。不需要特异的DNA序列。引物的长度通常为几个核苷酸至10个核苷酸。 功能：为DNA聚合酶提供游离的3’-OH。

RNase 在DNA复制完成时，必须去除RNA引物。 功能：去除RNA引物。 RNase 去除RNA引物 ↓ DNA聚合酶填补缺口

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原核生物中的三种DNA聚合酶 pol Ⅰ pol Ⅱ pol Ⅲ 5' → 3' 聚合酶活性 + + + 5' → 3' 外切酶活性 + - + + + 5' → 3' 外切酶活性 + - - 3' → 5' 外切酶活性 + + + 生理功能 去除引物 , 填补缺口 未知 DNA 复制 修复损伤 校正错误 校正错误 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

真核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶δ是负责DNA复制主要的酶，参与先导链和滞后链的合成。而DNA聚合酶ε的功能是补全去掉RNA引物后的缺口。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

真核生物DNA聚合酶 四种细胞核DNA聚合酶 α：无3’→5’外切酶活性 β：无3’→5’外切酶活性 δ：有3’→5’外切酶活性（校正功能） ε：有3’→5’外切酶活性 一种线粒体DNA聚合酶 γ：有3’→5’外切酶活性 真核DNA聚合酶均无5’→3’外切酶的活性，由FEN1（flapendonuclease, 以前简称MF1）和RNaseH完成引物的切除 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质 DNA聚合酶 α β γ δ ε 蛋白质分子量（KD > 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位 核 核 线粒体 核 核   5’ →3’聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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引物酶（Primase） ♦ 原核生物; 本质：依赖DNA的RNA聚合酶 （DDRP） Ecoli：60kD，DnaG 编码 ♦ 引发体(primosome)：引物酶＋引发前体（蛋白 因子i、n、n”、dnaC、n’、dnaB） 真核生物： Polα的p49/p58亚基具有引发酶的活性 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

5´ 3 3´ primase DnaC primosome Helicase(DnaB) 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

核酸酶（nucleases） 原核生物：RNaseH 真核生物：FEN1（flap endonuclease,以前简称MF1)和RNaseH 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

DNA连接酶（Ligases） DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

DNA连接酶催化的条件是：① 需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；② 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③ 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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♦ T4Ligase特性： 可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA； 可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平砌末端切口； 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

原核生物和真核生物复制体的成分比较 2.进行性因子 β亚基 PCNA 3.引发酶 DnaG polα的两个亚基p48 p58 1.复制多聚酶 polIII全酶 polδ/α 2.进行性因子 β亚基 PCNA 3.引发酶 DnaG polα的两个亚基p48 p58 4.解链酶 DnaB 多个 5.拓扑异构酶 DNA gyrase TopoⅡ 6.引物去除 RNaseH和polI FEN1和RNaseH 7.后滞链修复 polⅠ 和DNA连接酶 polδ/ε和DNA连接酶 8.单链结合蛋白 SSB RF-A 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.3 DNA复制的特点 ①半保留复制 ②半不连续性 ③复制方向： 是5 ′→3 ′，新合成的DNA链只能沿模板链的3 ′端延长。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

① DNA半保留复制 DNA分子由两条多核苷酸链组成，一条链上的碱基G只能与另一条链上的C相配对，A只能与T相配对，所以，两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核甘酸排列顺序。 DNA复制时，两条链先解开，每条链分别作为模板，严格按照碱基配对的原则互补合成新链。新链与模板链也是互补的。所以新合成的子代DNA与亲代DNA 是完全相同的。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

亲代DNA 子代 新合成 的链 半保留复制 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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半保留复制的实验依据 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术试验证实。 该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果： 15N DNA的密度比14N DNA的大，在密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

半保留复制实验 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

半保留复制进一步的实验证椐 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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3.4 DNA复制的一般过程 ①DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及DNA复制的引发。 ②DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。 ③DNA复制的终止阶段。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

①DNA复制的起始阶段 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示，称为复制子或复制单元(replicon)。 在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

大肠杆菌Ori由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome) DNA复制原点的“呼吸现象”: DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显 有些生物复制起始点Ori是富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

复制的起始 DnaA结合于oriC中的9bp重复序列，并促使3个13bp的重复序列发生解旋，HU蛋白起帮助作用。 DnaA引导DnaB-DnaC复合物进入解链区，并由DnaB继续解链。 DnaC的功能是将DnaB运送到复制模板。 DnaB促进引物酶DnaG的结合，二者构成引发体（primosome），引发开始。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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DNA复制的引发 解链：解链酶DnaB利用ATP水解的能量结合并解开双链DNA，单链DNA即被SSB蛋白结合。 引发：解链酶DnaB促进引物酶(primase)DnaG蛋白的结合，二者构成引发体(primosome)。 引发体结合到模板DNA上并合成一段短的RNA引物，当第一个核苷酸与RNA引物结合，标志着复制的开始。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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DNA复制方向 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

②DNA链的延长 DNA延伸均由DNA聚合酶Ⅲ来完成（以DNA的两条链为模板，以四种三磷酸脱氧核苷为原料，在引物及Mg2+的作用下，自引物的3′-OH端上开始，以5′→3′方向逐个加入脱氧核苷酸，使DNA链得以延长）。 前导链连续地合成出一条长链。后随链合成出冈崎片段， DNA聚合酶Ⅰ去除RNA引物，片段间形成了空隙，DNA聚合酶作用使各个片段靠近。最后在连接酶作用下，各片段连接成为一条长链。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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链的延伸—回环模型 PolⅢ同时催化前导链、后滞链合成。 前导链先于后滞链合成一个片段。 后滞链模板折返180度，使两条新生链都是5’-3’的方向。 当后滞链完成一个冈崎片段的合成，即与PolⅢ分开。同时，前移的引物酶已合成新的RNA引物，后滞链模板再次折返180度，进行下一个冈崎片段的合成。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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E.coli引发前体由Dna B, Dna C和SSBP组成. 主要在DNA随从链上开始，它连续地与引发酶结合并解离， Primase E.coli引发前体由Dna B, Dna C和SSBP组成. 主要在DNA随从链上开始，它连续地与引发酶结合并解离， 特殊RNA聚合酶，催化短片段RNA合成十几个至数十个核苷酸不等，DNA复制起始处做为引物 DNA复制简单示意图 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

③DNA复制的终止阶段 环状双链DNA，它的复制是典型的“θ”型复制 (由于形状像希腊字母θ)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。 已有研究证明大肠杆菌染色体DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制的。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

终止区（terminus region, ter）：都含有23bp的共同序列 终止区结合蛋白（Tus）：反解链酶 复制体解聚 子代双链DNA分子分开 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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小结 DNA的复制从固定的起始点开始，向两个方向等速生长前进。 (a)DNA改变双螺旋构象，解链酶解开双链，在单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的共同作用下合成先导链。 (b)复制叉进一步打开，RNA引物与DNA另一条链相结合。滞后链合成时，产生冈崎片段。 (c)复制叉继续前进，引物酶合成新的RNA引物，与DNA单链相结合准备引发合成新的冈崎片段。 (d)当所有的冈崎片段合成完毕后，引物被切除，最后由将许多冈崎片段连成一条完整的后随链。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.5 真核生物和原核生物DNA复制的区别 DNA复制的研究最初是在原核生物中进行的，有些原核生物的DNA复制已经搞得很清楚。真核生物比原核生物复杂得多，但DNA复制的基本过程还是相似的。在这里我们主要讨论一些重要的区别。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

①真核细胞DNA的合成只发生在细胞周期的S期(Synthesis phase)，而原核生物则发生整个细胞生长过程中。 . ② 原核生物DNA的复制是单起点，而真核生物DNA的复制则为多起点。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。 ③真核生物前导链的合成并不象原核生物那样是连续的，而是半连续的方式, 多起点复制，最后由连接酶连接成一条完整的新链。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

④真核生物DNA合成所需RNA引物及后随链冈崎片段的长度比prokaryote 要短。 The length of RNA primer are 10-60 nt and the size of Okazaki fragment are 1000-2000 nt in Prokaryote, but in eukaryote, which are 10 nt and 100-150 nt respectively(1/10). ⑤有两种不同的DNA聚合酶分别控制 the synthesis of leading strand and lagging strand. 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

In prokaryote, DNA pol I, II, III参与, DNA pol III 同时控制两条链的合成。 In eukaryote, 有, , ,  和  5种DNA polymerase, DNA聚合酶, 和  是DNA合成的主要酶,  控制不连续的后随链的合成,  控制前导链的合成.  是线粒体中发现的唯一一种DNA聚合酶. 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

⑥真核生物线性DNA末端具有端粒结构，需端粒酶保证染色体复制的完整性 原核生物染色体为环状. 而真核生物染色体是线性DNA，它的两端叫做端区(telomeres)，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。前面讲到所有生物DNA聚合酶都只能催化DNA从5′→3′的方向合成，因此当复制叉到达线性染色体末端时，前导链可以连续合成到头，而由于随从链是以一种不连续的形式合成岗崎片段，所以不能完成线性染色体末端的复制。如果这个问题不解决，真核生物在细胞分裂时DNA复制将产生5′末端隐缩，使DNA缩短。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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由此可见端粒酶在保证染色体复制的完整性上有重要意义(why?)。 近十多年的研究表明，真核生物体内都存在一种特殊的反转录酶叫做端粒酶(telomerase)，它是由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA，再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链(下图)。 由此可见端粒酶在保证染色体复制的完整性上有重要意义(why?)。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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端粒(telomere)： 真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 结构特点： 1. 由末端单链DNA序列和蛋白质构成 2. 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列 功能： 1.保证线性DNA的完整复制； 2.保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

端粒酶(telomerase) 特点： 1. 由RNA和蛋白质构成的复合物 功能： 2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为 模板逆转录合成端粒DNA 功能： 合成端粒DNA，维持端粒的长度 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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端粒及端粒酶的意义： 近些年来，人们发现，染色体端粒DNA的结构，特别是细胞内端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老调亡以及肿瘤发生密切相关。 端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化(aging)及肿瘤的发生有一定关系。 近些年来，人们发现，染色体端粒DNA的结构，特别是细胞内端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老调亡以及肿瘤发生密切相关。 如胚原细胞，端粒酶活性较高，端粒长度也未缩短，而体细胞端粒酶活性低，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去其增殖能力。某些肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构至使染色体稳定。有关端粒DNA的结构，复制机理及其功能已成为生命科学研究的热点。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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3.6 DNA复制的几种方式 1.DNA复制的方向 单起点、单方向 多起点、单方向 单起点、双方向 多起点、双方向 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

①单一起点的单向复制。 (如腺病毒) 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

②单一起点的双向复制（如T7噬菌体） ③多个起始点的双向复制（如真核生物） 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

2.环状DNA双链的复制 ①θ型复制（如大肠杆菌） ② 滚环型复制（ΦΧ174单链DNA病毒） 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

θ复制 θ复制：环状DNA在复制起点解开成单链状态，分别以链作为模板，各自合成其互补链。由于其形态像希腊字母θ，故称之为θ复制（θ replication），由于θ结构是首先由J.Cairns从大肠杆菌中观察到的，所以又称Cairns复制。 绝大部分革兰阴性菌的质粒、多瘤病毒等环状DNA多采用这种方式复制。θ复制有单向和双向两种类型，除少数质粒（如ColE1）为绝对单向外，大多数质粒一般都采用双向等速的复制方式 。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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滚环复制 ΦΧ174单链DNA病毒DNA的复制方式 滚环复制：双链环状质粒DNA以某种方式切断其中一条环形链，其5‘端与特殊蛋白相连，3’端不断地由DNA pol催化，以未切断的一条环形链为模板，加上新的核苷酸。由于3‘端不断延长，而5’端不断被甩出，好像中间的一个环在不断滚动一样，因而称为滚环复制（rolling circle replication）。当这条链甩到某一长度时，开始复制其互补链。 ΦΧ174单链DNA病毒DNA的复制方式 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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如果DNA的延伸方向是 3’ → 5’ DNA的复制方向是 5’ → 3’ G ppp OH A T C G + 5’ ppp OH 3’ G A T C G 5’ ppp OH 3’ 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

D环复制：线粒体和叶绿体DNA的复制方式 线粒体DNA的复制呈D型。这是由于线粒体环状DNA两条链的复制起始点不在同一位置，并且起始又有先后。复制开始时，先以亲代的负链为模板，形成一新链。然后将亲代分子正链置换出来，在此阶段呈现D环形。随着正链置换扩大，当D环状达到 全环的2/3时，正链的起始点也暴露出来，从正链模板的起始点才开始子链的合成。由于两个亲代链的起始点不同，合成的时间不同，所以D环型复制是不对称复制。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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3.起始方式 1）从头起始（de novo initiation）:θ复制、D环复制、线状DNA的复制 2）共价延伸（covalent extesion）:新链从原有的亲链上合成 滚环复制起始方式 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.7 DNA的损伤与修复 一、DNA的损伤（突变） 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。 常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 （一）引起突变的因素： 1．自发因素： (1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 (2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。 (3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

2．物理因素： 由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。 3．化学因素： (1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。 (3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。 (4)碱基类似物：如5-FU(5-氟尿嘧啶 )，6-MP(6-巯基嘌呤) 等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。 (5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

6-MP(6-巯基嘌呤) 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

（二）DNA突变的类型： 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

碱基的转换 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

2．错义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 （三）DNA突变的效应： 1．同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基的改变但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。 2．错义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 3．无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。 4．移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

二、DNA损伤的修复 1.光修复（light repairing） 2.切除修复（excission repairing） 3.重组修复（recombination repairing） 4.SOS修复（SOS repairing） 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

1．光复活： （light repairing）： 这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从DNA上解离。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

2．切除修复(excision repairing)： 是最主要的修复方式。通过一种特殊的内切核酸酶切除DNA分子中的损伤部分，同时以另一条完整的DNA链为模板，由DNApol I催化填补被切除部分的空隙，再由DNA连接酶封口，使DNA恢复正常的结构。例如大肠杆菌中存在一种称为Uvr修复系统，可以修复胸腺嘧啶二聚体或其它因素造成的DNA损伤。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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3．重组修复(recombination repairing)： 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。 当DNA分子的损伤面较大，还来不及修复就进行复制时，可利用重组过程进行修复。随着多次复制及重组修复，损伤链所占比例越来越少，不影响细胞的正常功能。重组修复的酶有多种，其中最重要的RecA蛋白 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

4．SOS修复： 是一种应急修复机制，当DNA分子受到严重损伤时，细胞处于危险状态，正常修复机制均已被抑制，此时只能进行SOS方式的修复。这种修复的机制是：DNA受到严重损伤时，recA蛋白的蛋白酶活性被活化，使得LexA蛋白被水解。LexA蛋白是一种抑制蛋白，抑制与SOS修复有关基因的（recA基因，UurABC基因以及其它SOS基因）的表达，当它被水解后，这些基因的抑制被解除，于是SOS修复酶系大量表达 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3.8 DNA的转座 DNA的转座 （DNA transposition） 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

1、转座成分概述 1）转座子(元)或转座元件 (transposon or transposable element): 即能够反复插入到基因中许多位点的特殊DNA片段，它们可从一个位点转移到另一个位点，从一个复制子到另一个复制子。（在转移时原来位置上的这些结构依然存在或不存在）。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

♣ 不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座作 用与供体和受体之间的序列无关。 2）特点： ♣ 不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座作 用与供体和受体之间的序列无关。 ♣ 原核生物和真核生物均有转座子。 ♣ 转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体间跳 跃。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

A 简单转座子（simple transposon） 或（插入序列 insertion sequence IS ） 3）种类与特点 （1） 两种类型： A 简单转座子（simple transposon） 或（插入序列 insertion sequence IS ） B 复合转座子（composite transposon） （2） 特征： a）两端有20～40bp的反向重复序列(IR) b）具有编码转座酶（transposase）的基因 c）复合转座子除转座酶基因外还有1—数个基因。 d）转座酶催化转座子插入新位点。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

♣ 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分，是一个自主的单位，每种IS均编码自身转座所需的蛋白质。 A 插入序列 ♣ 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分，是一个自主的单位，每种IS均编码自身转座所需的蛋白质。 ♣ 命名： IS＋编号（鉴定类型） 长度 700～2000bp 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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♣ 表示法：通常以Tn和后面加上数码表示， 如Tn903。 ♣ 结构: a. 除有转座酶基因外还有其它表型基因， B 复合转座子 ♣ 表示法：通常以Tn和后面加上数码表示， 如Tn903。 ♣ 结构: a. 除有转座酶基因外还有其它表型基因， 如：抗药基因，使宿主具表性效应。 b. 两侧有重复序列。 c. 有的转座子的重复顺序就是IS。 ♣ 功能：和 IS 一样可以从一个位点转座到另一个位点。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

Tn1681 大肠杆菌热稳定毒素I 基因 552 bp IR IS1 IS1 复合转座子结构示意图 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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♣ 两种类型 2.5 kb 20 kb a) Tn / TnA family 抗抗生素基因 Tn3 IR TnpA TnpR AmpR IR ♣ 两种类型 2.5 kb 20 kb a) Tn / TnA family l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、 抗抗生素基因 Tn3 IR TnpA TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶 regulator β- 内酰胺酶 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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b）两端重复序列为IS的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子 其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

IS IS L IS R 臂 中心区 臂 transposition 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

♣ 两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态 ♣ 不同时，主要依靠一个 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

b）转座噬菌体 Mu phage （巨型转座子 ） 以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解） att L C A B S U att R 150bp 1.5kb gin P G 倒位区 38kb C repressor for A, B B 33 kd 与转座有关 A 70 kd 转座酶 U, S 毒性蛋白 attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

Mu的插入途径 a） 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄DNA b） 进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

3、转座子的转作机制与模式 转座子插到新的位点上，靶DNA上产生交错切口，所形成的单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，由DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶封闭切口。 转座结束后，靶DNA发生一个正向重复序列。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

靶位点直接重复序列的形成 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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4.转座作用的遗传学效应 （1）转座引起插入突变 （2）转座产生新的基因 （3）转座产生的染色体畸变 （4）转座引起生物进化 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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复习思考题 1.名词解释：复制子、复制体、半保留复制、前导链、滞后链、冈崎片段、SSB、拓扑异构酶、OriC、端粒酶、无义突变、同义突变、错义突变 2.试述双链环状DNA的几种主要复制方式。 4.真核染色体末端端粒DNA是如何进行复制的？ 5.参与DNA复制过程的主要酶类有哪些？ 6.试比较大肠杆菌DNA聚合酶与真核生物DNA聚合酶的异同。 7.试述大肠杆菌细胞DNA复制的基本过程。 8.试述DNA损伤修复的方式及其修复机制。 9.何为DNA的转座子？包括几种类型？DNA转座产生什么遗传效应？ 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

“http://www.tudou.com/programs/view/N_1bPF1W_t4/”。 2017/4/8 李晓玲 编写与制作

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