霉菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌检测中常见问题的分析 青岛海博生物技术有限公司 姜文生 2004-12-24

主要内容 霉菌 大肠菌群 金黄色葡萄球菌

霉菌 霉菌：不是分类学上的名词，而是一些丝状真菌的通称，属真菌的一部分.其对人类的作用具有双重性:有利的方面是它可以用来酿造、工业发酵、抗生素和酶制剂的生产等;不利方面是它能引起农副产品、食品、原料及器材的腐烂，也感染并引起人类和动、植物的多种疾病.

少数种类，如黄曲霉，能产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素是一种致癌物质，危害人、畜的健康和生命。因此，霉菌的检测对于食品的安全性很重要。 食品中常见的霉菌:毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属等

霉菌在孟加拉红琼脂上的菌落特征

酵母菌在孟加拉红琼脂上的菌落特征

※检测中的注意事项： 1、 取样的代表性。 2、取样工具的无菌。空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。 3、 检样的操作。 （1）由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。

（2）样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。 4、培养温度和时间。培养温度25-28℃培养，3天后观察，需培养观察一周。 ※霉菌检验中常用的培养基：孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂等 。

※检样中常见的问题： 1、 不同稀释度计数结果相同。 2、 不生长或生长很好连成片无法计数。

※原因： （1）稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。 （2）由于培养基不适宜，PH值低等，致使生长较慢。 （3）观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需3d后才能观察出结果。每天都要观察结果。

大肠菌群 大肠菌群：是只一群能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏无芽孢杆菌 。该菌主要来源于人畜粪便。 检测该菌的方法主要有MPN法，平板计数法。 MPN法中主要用到的是LST、BGLB、EC肉汤等。 平板计数法主要用DC、VRBA等。

※在检测该菌时易出现的问题： 1、 LST、BGLB、EC等在灭菌时小倒管中气泡排不尽。 2、气泡不易观察。 3、VRBA、DC平板上菌落特征不易辨认。

2、观察气泡时，要对光倾斜试管，使小倒管紧贴在试管壁上，便于观察。 ※原因： 1、在分装LST、BGLB、EC时，小倒管中有水柱；此外，高压灭菌时，需急排气，灭菌后迅速冷却。 2、观察气泡时，要对光倾斜试管，使小倒管紧贴在试管壁上，便于观察。 3、熟悉大肠杆、大肠菌群在上述平板上的特征,必要可做一些阳性的对照。有些食物残渣会影响观察结果，这样需要我们在培养前仔细观察平板的状态，大的食物残渣可以做一些标记。

大肠菌群在LST中的生长情况

大肠菌群在DC上的菌落特征

金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌：是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、败血症等，其毒性的强弱取决于产生的毒素和侵袭性酶，例溶血素酶、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶。

B-P琼脂上金黄色葡萄球菌有黑色的菌落中心，周围有半透明的卵磷脂沉淀环。 甘露醇卵黄琼脂上的特征是菌落黄色，周围也有卵磷脂沉淀环。 甘露醇高盐琼脂上的菌落特征与甘露醇卵黄琼脂上的菌落特征相同，不过，菌落周围没有卵磷脂沉淀环。  

金黄色葡萄球菌在B-P上的菌落特征

※检样中常见的问题： 1、  平板的状态：透明、有絮状物。 2、  凝固酶实验的观察。

※原因： 1、不同的厂家的培养基平板制好后的状态有所不同，主要取决于亚碲酸钾卵黄增菌液的不同。我们公司采用的鸡蛋是山鸡蛋，卵磷脂含量较高，因此制备好的平板一般透明度较好，接种金黄色葡萄球菌后，菌落特征较易观察。 2、在添加亚碲酸钾卵黄增菌液时，温度的掌握，不宜太高，过高易使卵黄变性，也不应太低，太低琼脂易凝固。

3、将金黄色葡萄球菌接种到兔血浆上后，每半小时观察一次，观察凝固时，将血浆轻轻倾斜或慢慢倒置，如有流动，既证明没有凝固。如若不明显，可补做DNA酶实验。

血浆凝固酶实验观察

谢谢

在微生物操作中常见问题的讨论与分析 青岛海博生物技术有限公司 姜文生 2004-12-24

主要内容 1、划线获得单个菌落的方法 2、涂布和倾注的区别 3、培养基配制时应注意的问题 4、平板的保存 5、产品的保存 6、观察时间的掌握

6、观察时间的掌握 7、添加剂的添加 8、培养温度的掌握 9、接种方法 10、革兰氏染色方法 11、生化实验 12、关于杀菌的几个概念

1、划线获得单个菌落的方法。 划不出单个菌落的原因： （1） 平板上有过多的水分 （2） 划线时接种环未经反复灼烧 （1）       平板上有过多的水分 （2）       划线时接种环未经反复灼烧 （3）       多区划线，三区或四区划线

四区划线的方法

2、  涂布和倾注的区别： 涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，影响计数的准确性。 涂布更为准确，但不利于观察菌落的状态。

3、 培养基配制时应注意的问题 （1）灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量。 3、  培养基配制时应注意的问题 （1）灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量。 （2）琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分。 （3）培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏。 （4）含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。

4、平板的保存： 大多数平板如VRBA、DC、、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。这样保证培养基的质量不会发生变化，同时，也减少了杂菌污染的可能。

5、 产品的保存： （1）干粉培养基：避光干燥；结块后不能使用。 5、  产品的保存： （1）干粉培养基：避光干燥；结块后不能使用。 （2）亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存；使用时，要常温解冻，避免水浴加热。 （3）抗生素类：冷藏保存。温度过高会导致灵敏度的下降。 （4）兔血浆：冷藏保存；少量的红色不会影响结果。

6、 观察时间的掌握： 按SN、GB等标准或培养基的使用说明所述时间进行观察，时间过短或时间过长，单菌落的特征都不会很明显。如单增李斯特氏菌显色培养基，时间短单菌落看不到卵磷脂环，时间长绵羊李氏菌也会产生沉淀环。OXA、PALCAM的观察也如此，时间过长，李氏菌使整个平板成黑色，不利于观察单个菌落。

7、 添加剂的添加： （1）温度的掌握。 卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。 （2）定量。 7、  添加剂的添加： （1）温度的掌握。 卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。 （2）定量。 过多会抑制一些目标菌，太少又导致杂菌的过度生长。

8、 培养温度的掌握： （1）真菌类。25-28℃培养 （2）细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。 8、  培养温度的掌握： （1）真菌类。25-28℃培养 （2）细菌类。李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。 （3）其他细菌一般在36℃左右。

9、接种方法： 常用的方法主要有： 划线接种、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。

10、革兰氏染色方法： 染色时间的掌握。 冲洗的方法。 染色的顺序： 制片-固定-初染-媒染-脱色-负染

11、生化实验： （1）接种的方法。 （2）氧化型和发酵型实验操作。 （3）阳性菌种的对照。 （4）接种前的纯化。 （5）挑取单个菌落进行一系列的生化。

12、关于杀菌的几个概念： （1）抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。 （2）死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。

（3）防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止食物霉变。 （4）消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。

（5）灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有病原微生物的一种措施。 （6）化疗：利用具有选择毒性的化学物质，例磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织或病变细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对有机体无毒害作用的治疗措施。

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