食品微生物检验 规范操作基础培训 5 制片、染色及显微观察 福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05 食品微生物检验 规范操作基础培训 5 制片、染色及显微观察 福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05

§ 5 制片、染色及显微观察 主要内容： § 1 清洗、消毒和灭菌操作 § 2 培养基的制备 § 3 采样和取、制样 § 4 接种、分离纯化 § 1　清洗、消毒和灭菌操作 § 2　培养基的制备 § 3　采样和取、制样 § 4　接种、分离纯化 § 5　制片、染色及显微观察 § 6　实验室安全基础知识　

5.1 显微操作 显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。 5.1　显微操作 显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。 显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。 食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。

显微镜的使用方法 用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察 。

低倍镜操作方法 1.两眼从侧面注视 低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距2～3mm时停止； 2.左眼注视 （注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止； 3. 再用微调焦螺旋调至清晰。 注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰

高倍镜操作方法 1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央； 2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面； 3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。 注意：高倍镜观察时，光线需增强。

油镜操作方法 1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央； 2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油； 3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止）； 4.用微调焦螺旋调至清晰。 注意：油镜的操作需要较强的关线，故需将光线调至最强。 用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍或100倍）选择合适的视野（油镜镜筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等标志）

油镜用后的处理： 第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油； 第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹； 第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

普通显微镜的保养 (1)观察完后，移去观察的载玻片标本。 (2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 (3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。 (4)将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。 镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸 ，物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

§5.2 制片和染色 染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差, 必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。 细菌带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。 　 微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。

细菌的大小与形态 细菌的测量单位： 微米(μm) 球菌 细菌的形态 杆菌 螺形菌

染色方法 (一)简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。

革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类： (二)复染色法 　 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。 　革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类： 　染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 　染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G―表示。 　 细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

实验材料 1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯、蜡笔等。 2.草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃红染液、石炭酸复红染液 3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌

实验内容与步骤 (一)细菌的简单染色步骤 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检 1．涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2．干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3．固定 手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。 4．染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 5．水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6．干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。 7．镜检

1．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。 2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 (二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察 1．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。 2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。 5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。

革兰氏染色图解 革兰氏染色试剂

步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上

步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上

步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层

步骤4：风干

步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定

步骤6：结晶紫染色1分钟

步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片

步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗

步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗

步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗

大肠杆菌（Escherichia coli）革兰氏染色图 革兰氏染色阴性杆菌（红色）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）革兰氏染色 革兰氏染色阳性球菌（紫色）

注意事项 1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。 2 ．选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。

鞭毛 化学组成： 鞭毛蛋白 功能： 运动器官 与致病有关 鉴定分类细菌

荚膜 化学组成： 多糖或多肽 功能： 抗吞噬作用 粘附作用 抗有害物质损伤作用

芽孢 脱水而成，为细菌休眠形式 功能与医学上意义： 对外界的抵抗力增加 可发芽成繁殖体有致病性 有鉴别作用 应以杀死芽胞为灭菌效果的指标

菌毛 化学组成： 菌毛蛋白 种类与功能： 普通菌毛—与致病有关 性菌毛—与遗传变异有关

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