第二十一章 临床免疫检验的质量保证

第一节 概述 质量保证(Quality Assurance,QA) 为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。 室内质量控制（Internal Quality Control,IQC) 由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度。

室间质量评价 （External Quality Assessment, EQA） 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果

准确度 (accuracy) :待测物的测定值与其真值的一致性程度。 偏倚 (bias) 待测物的测定值与一可接受参考值之间的差异。

精密度(precision) 在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。

测定的精密度与准确度之间的关系 准确度好的实验，其精密度不一定好； 准确度差的实验，其精密度则不一定差；反之亦然。

重复性条件(repeatability conditions) 是指在短的间隔时间内，在同一实验室对相同的测定项目使用同一方法和同一仪器设备，由相同的操作者获得独立的测定结果的条件。

批 (Run) 在相同条件下所获得的一组测定。 均值（Mean） 标准差（Standard deviation, SD) 变异系数（Coefficient of variation, CV）

正态分布(Gaussian distribution) 当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，又称高斯分布。

正态分布的基本统计学含义可用均数、标准差（s）和概率来说明。

诊断敏感性（sensitivity of diagnosis） 是指将实际患病者正确地判断为阳性（真阳性）的百分率。 诊断特异性（specificity of diagnosis） 是指将实际无病者正确地判断为阴性（真阴性）的百分率。

诊断效率（efficiency of diagnosis） 是指能准确区分患者和非患者的能力。

阳性预测值（（positive predictive value, PPV） 是指特定试验方法测定得到的阳性结果中真阳性的比率。 阴性预示值(negative predictive value, NPV) 是指特定试验方法测定得到的阴性结果中真阴性的比率。

第二节 免疫检验 的质量控制原则

标本的正确收集及处理 标本类型及采集容器 标本采集时间及患者准备 内源性干扰因素 外源性干扰因素

标本类型及采集容器 最常用的标本：血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液 。 建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器。

标本采集时间及患者准备 激素和治疗药物 感染性病原体抗原、抗体 肿瘤标志物 特定蛋白

可能影响测定结果的标本因素 内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等 外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融

类风湿因子干扰的排除 稀释标本 改变标记抗体 用变性IgG预先封闭标本中RF 测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RF 使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体

补体干扰 固相抗体和标记二抗可抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。 固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或结果偏低。

补体干扰的排除 56℃ 30min加热可使标本中补体C1q灭活 使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体

异嗜性抗体的干扰 天然的异嗜性抗体（IgG）可分为两类: 可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域 可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳性反应。

异嗜性抗体干扰的排除 使用特异的兔F(ab’)2片段作为固相或标记抗体。 在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。 使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或标记抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。 使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。

抗鼠Ig 抗体的干扰 抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定，可产生假阳性结果

干扰排除可采用下述方法: 使用特异的抗体F(ab’)2片段作为固相或测定标记抗体。 在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。 使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。

自身抗体干扰 自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结合形成复合物，在免疫测定方法中可干扰相应抗原抗体的测定。 为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离。

溶菌酶干扰 双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和标记的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。

标本溶血 注意避免出现严重溶血。 血红蛋白类似过氧化物的活性，使反应显色。

标本被细菌污染 细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用 细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

标本贮存时间过长 标本在2~8℃下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法免疫测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。 血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在－70℃以下。

标本凝固不全 血液采集后，离心分离血清没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果 血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

冰冻保存标本避免反复冻融 反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。

标准化操作及流程 试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP)

标准品和质控品的应用 标准品和质控品的分类 标准品和质控品的基本条件

标准品和质控品的分类 一级标准品为国际标准品 二级标准品为国家标准品 二级标准品为商品校准品 标准品即含量确定的处于一定基质中的特性明确的物质。 标准品分级: 一级标准品为国际标准品 二级标准品为国家标准品 二级标准品为商品校准品

实验室的环境、设施和设备 临床免疫检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明、空调及湿度维持设备 实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。

第三节 质量保证、室内质控 和室间质评之间的关系 IQC仅覆盖标本收集、实验室测定过程和结果报告及其解释分析步骤；而EQA还包括一个较大范围的实验室活动，诸如在标本接收中样本处理的可靠性，以及测定结果的报告和解释。QA覆盖了更宽范围的活动，最为重要的是标本收集、结果报告和解释阶段。QA还应评价实验报告的发出周期（及时性）、完整性和简洁性。实验室工作的质量保证在确保患者治疗质量上有重要意义。

第四节 常用免疫检验的质量控制 定性免疫检验 定量免疫检验

定性免疫检验质量控制 已知的弱阳性质控:每次测定都应至少带一个已知的弱阳性对照，从而有助于判断临床标本的检测结果是否有效。 阴性质控:必需

定量免疫检验质量控制 定量免疫检验方法通常需要使用全自动免疫分析仪，由于其对测定结果要求有准确的量值，因此在测定时须用校准品对仪器进行校准. 室内质控则应选择特定试剂盒或方法的测定范围内的高、中和低三种浓度的质控品，以监测对不同浓度标本的测定变化。

第五节 免疫检验 室内质量控制的数据处理

统计学质量控制 统计学质量控制:使用室内质控物与临床常规标本同时检测，然后根据室内质控物的测定结果，采用统计学的原理方法判断所进行的临床常规标本测定是否在控的一种质量控制措施。

统计学质控的特点 检验误差有两类：一是系统误差，一是随机误差。 系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。 随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全避免和控制。

统计学质控的功能 统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。 开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。

统计质控方法 基线测定 质控规则的表达方式及定义 Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 累积和 (CUSUM) 质控方法 “即刻法”质控方法

基线测定 最佳条件下的变异（Optimal conditions variance, OCV）和常规条件下的变异（Routine conditions variance, RCV）； 当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则RCV是可以接受的。以上为批间变异。 批内变异的测定； 室内质控物的测定准确度的评价。

质控规则的表达方式 通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值±1～3SD来表示。 当质控测定值超出控制限L时，即该批测定判为失控。 常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值±3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值±3s范围，即可将该批测定判为失控。

质控规则的功能 简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。 当整个质控过程中使用同一个质控物时，可用来判断单个或多个测定批内该质控物的测定值是否失控。 当整个质控过程中使用两个或两个以上的不同的质控物时，可用来判断同一或多个测定批内的两个或两个以上的质控物的测定值是否失控。

常用质控规则的符号及定义 符 号 定 义 12S 一个质控测定值超出±2s控制限。 13S 一个质控测定值超出±3s控制限。 符 号 定 义 12S 一个质控测定值超出±2s控制限。 13S 一个质控测定值超出±3s控制限。 22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。 R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。 41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。 7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。 10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（X）的同一侧。

Levey-Jennings质控图方法 也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。 二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。

Levey-Jennings质控图

Levey-Jennings质控图基本特点 (1)统计学含义:稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。

(2)对待质控品应如对待病人标本一样同等对待，不能进行特殊处理，在每批病人标本测定的同时测定质控品，将所得结果标在质控图上，质控品在控时，方能报告该批病人标本的测定结果，质控品失控时，说明测定过程存在问题，不能报告病人标本结果，应解决存在的问题，并重新测定在控后方能报告；

（3）当使用一个以上浓度的质控品想在同一张质控图描点时，则质控图上均值和s可不标具体数据，而仅以和s表示；

质控图的记录 质控结果 日期 试剂 质控物批号和含量 测定者姓名等。

Levey-Jennings质控图结合 Westgard多规则质控方法 最初常用的有六个质控规则，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S规则作为告警规则。 13S和R4S规则反映的是随机误差。22S、41S和10X反映的是系统误差，系统误差超出一定的程度，也可从13S和R4S规则反映出来。

Westgard多规则质控方法的特点 在Levey-Jennings质控图方法的基础上产生，具有Levey-Jennings 质控图方法的优点，可通过相似的质控图来进行分析。 假失控和假告警概率低。 误差检出能力增强 。

累积和 (CUSUM) 质控方法 累积和 (CUSUM) 质控方法于1977年由Westgard等提出,对系统误差有较好的测出能力。

累积和 (CUSUM) 质控图

“即刻”质控方法 “即刻法” 的实质是一种统计学方法,即Grubs异常值取舍法。 只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。

免疫检验质量保证的意义 IQC可确保每次测定与确定的质量标准一致。 EQA的实施，将有力地促进临床免疫检验的标准化。