第四节 培养细胞的生长增殖过程

一体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。 传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。

1.原代培养（Primary Culture）期： 　　也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

2．传代期 　　初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。

初代培养 细胞系 （连续细胞系） 16 14 12 10 8 6 传代期 老化 0 2 4 6 8 10 12 14 周

3．衰退期： 　　此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。

二培养法 培养瓶培养法 培养板培养法

A 培养瓶培养法 所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。 早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。

与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养，就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。这样具有以下几优点：。 (1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。 (2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。 （3）增加了培养瓶的培养面积。

B 培养板培养法 培养板培养法曾被称为微量培养法，是现代体外培养技术最为常用的方法之一。具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。

三 原代培养技术 幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。 任何动物细胞培养均从原代培养开始。 原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养 1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？ 提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。

原代培养 包括：取材、分散细胞、接种、培养等． 在所有操作中，多都要注意保持培养物及生长环境的无菌条件。

组织块培养 组织块的原代培养方法，首先从机体某部位取下组织，方法： 处死动物 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液 吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块 吸管取出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养液 培养 传代

组织块也可用两只手术刀片将组织块切碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间长，容易污染。 对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。

组织消化培养 1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组织分散成细胞团或单细胞。胰蛋白酶，适用于细胞间质较少的软组织。 2、培养过程： 处死动物 ---- 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液 吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块 :组织消化-----吸管取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 ------ 培养--- 传代 接种 加入培养基 培养（每次换液后更换新的瓶塞 ）

传代培养 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2．半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

3．贴壁生长细胞传代 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。

贴壁细胞传代-消化过程 1.首先将超净工作台用紫外 　光灯照射灭菌20-30分钟；

2. 关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)

3.将消毒过的所用物品放入超 　净工作台中；

4.将培养好的HeLa细胞培养 皿放入超净工作台中；

5.用无菌吸管将细胞上原有的 培养液吸净，弃去培养液。 5.用无菌吸管将细胞上原有的 　培养液吸净，弃去培养液。 在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明：

6. 分别取1毫升0.25%胰酶消化液放入培养皿中

7.将加有胰酶消化液的培养皿 放入37℃温箱中消化1分钟

8.从温箱中取出培养皿后 用手轻轻拍打培养皿的边缘；

9.用倒置式显微镜观察细胞 　是否完全脱落

细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代： 有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。

10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应 如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。

刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：

细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：

细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：

检查细胞形态及活力：状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。

检查营养液PH及污染： 新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。ＣＯ２培养箱可自动控制5%ＣＯ２ 的含量。

细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数

程序 　 　用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，　　 以便滴加细胞悬液.　 　取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。　 　从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。　　 注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。　 　镜下观察计数： 计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算　　 左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。 　按下式计算： 细胞数/毫升原液= 　 注意：　　　 　镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米 　　时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。

细胞计数： 细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数/毫升表示。　用品：细胞悬液,培养液,计数板。　　　　

计数法: 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

寻根问底 胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？ 提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。

贴壁生长细胞传代小结 加消化液得到 分散的单细胞 倒掉消化液 加培养液终止消化 吹打成细胞悬液 接种2-4个培养瓶生长

贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体表面才能正常生长，最终在附着表面扩展成单层。

贴壁培养的材料与系统 贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和高度的表面活性。如果是有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。主要材料有： 玻璃 、塑料、 金属、微载体。

贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系统的核心是采用可以摇动或转动的圆筒培养容器，能使细胞交替接触培养液和空气。但是，该系统具有表面积有限、培养条件检测受到限制、劳动强度大、占用空间大等不足。

凡·维茨尔开发的微载体培养系统一定程度上克服了这些缺陷。 微载体培养动物细胞是一种适合大规模生产动物细胞生物制品的一种非常有价值的培养技术

贴壁生长的细胞生长特性 原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就可铺满生长表面，形成致密的细胞单层。这种方法易于观察细胞生长状况，适宜于实验室研究。但是如需继续培养，需将单层细胞再分散，稀释后再重新接种，进行传代培养。

贴壁生长的细胞一般生长过程是： (1)游离期： 接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于细胞质的回缩，各种形状的细胞都开始变圆。 (2)吸附期： 细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、传代细胞较快，组织块、较大细胞团较慢。一般多数细胞都可在24h内贴壁，平均贴壁时间大约5-20min。而细胞状态不好及濒死细胞、培养基偏酸或偏碱、培养瓶不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。

(3)繁殖期： 圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，此时虽有细胞运动，却无细胞分裂。经过一段停滞，开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片，这时细胞的运动及分裂都会停止。这种由于细胞间的接触而发生抑制的现象称之为接触性抑制。

(4)退化期： 细胞长满培养瓶壁达到一定密度后，随着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞开始退化。细胞轮廓变强，细胞内有膨胀的线粒体颗粒堆积。如不及时传代，细胞会从瓶壁上脱下来。

贴壁培养优点 (1)贴壁培养比较容易更换培养基。 (2)容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的。 (3)更有效地表达同一产品。 (4)可以方便地调节培养液和细胞比例。 (5)易于观察细胞生长状况。

【思考题】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。

旁栏思考题 3.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？ 提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。

4.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 提示：血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。

4小时游离细胞

经24小时培养后，生长情况为：

经48小时培养后，细胞已长成致密单层：