第十四章 基因诊断和基因治疗 表型的改变是由基因异常造成的 表型的改变是由基因异常造成的

讲授内容及要求 一、基因诊断的基本概念 二、基因诊断的基本技术 三、基因诊断的应用 四、基因治疗:概念、方式、 程序、应用

第一节 基因诊断基本概念和流程 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断 表型的改变是由基因异常造成的 基因的改变是引起疾病的根本原因

基因诊断：应用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在,变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断 一.概念 基因诊断：应用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在,变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术 DNA诊断 RNA诊断

基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义

二、基因诊断的特点 针对性强： 以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断” 。 特异性高： 以分子杂交技术为基本原理 灵敏度高： 基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人 类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的 单碱基改变。而且待测标本微量。

适应性强： 基因探针可为任何来源，任何种类，探针序 列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广。 早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾 病作出明确诊断，它还可在产前早期 诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜 伏期的病原微生物、还可预测和早期 发现某些恶性肿瘤。 早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾 病作出明确诊断，它还可在产前早期 诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜 伏期的病原微生物、还可预测和早期 发现某些恶性肿瘤。

三.基因诊断的基本流程 样品抽提 RNA cDNA DNA PCR扩增 分子杂交 杂交信号检测

第二节 基因诊断的基本技术 核酸分子杂交 PCR 限制性片段长度多态性分析(RFLP) DNA序列测定 DNA芯片技术

一、核酸分子杂交（hybridization） 这是应用最广泛的一类基因诊断技术 根据碱基互补配对原则，将样品DNA/RNA双链经变性处理，加入已标记的单链DNA/RNA探针，样品中与探针互补的DNA/RNA序列可与探针形成杂交双链DNA，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。

分子杂交技术过程 ☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析

分子杂交的基本方法 原位杂交 斑点印迹杂交 Southern 印迹杂交 Northern 印迹杂交

（一）原位杂交 不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探针杂交。 可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。

（二）斑点印迹杂交 可检测特定基因的存在或表达情况。 把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与标记核酸探针杂交。通过纤维素膜杂交斑点的放射自显影或胶片斑点的光吸收值扫描可以测定待检核酸的含量。 可检测特定基因的存在或表达情况。

(三) Southern 印迹杂交 该方法主要用于检测基因组中待测的基因或序列 1975年，英国Southern创建 概念: 将制备的DNA经酶切电泳、再转印到固相支持物上，用探针杂交后进行检测的方法，用于 DNA/DNA杂交。 该方法主要用于检测基因组中待测的基因或序列

(四) Northern 印迹杂交 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳

总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色

二、PCR技术 基本原理－DNA复制 三个步骤 变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension)

通过PCR能扩增出所需的特异性条带

PCR的原理

标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.1~2ug 引物： 各0.2~1umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul

三、限制性片段长度多态性（RFLP）: 限制性核酸内切酶能够识别特定的DNA序列，并在其中的某一特定碱基位点（限制性位点）将DNA切断，使 DNA形成限制性片段. 粘性切口 平端切口

RFLP技术珍断疾病的机理: 由于基因突变的结果,使DNA上原有的核酸内切酶的识别序列发生改变,导致使用限制酶去切割时得到的结果与不发生突变的结果完全不同,可借此做出诊断. 如:某些遗传性疾病发生特异的点突变,而点突变位置正好是某些酶的识别和切割点,可用酶切方法做出诊断.

RFLP的主要步骤 RFLP主要有以下两种类型： DNA→酶切→Southern杂交分析 DNA→PCR →酶切→电泳分析 序列多态性 点多态性 序列多态性

点多态性 表现为DNA链中发生单碱基突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。这类多态性实际是双态的，即有或无酶切位点。据此，样品DNA经特定内切酶消化或Southern印迹杂交即可诊断某些疾病。

2. 序列多态性 DNA链内发生较大片段的缺失、重复、插入等变异。结果，内切酶位点本身碱基序列虽未改变，但原有内切酶位点在基因组中的相对位置改变了从而导致RFLP。也可用Southern印迹杂交诊断相关疾病。

四、基因芯片 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将已知DNA片段或cDNA片段作为探针，紧密有序地排列固定于支持物（多聚赖氨酸硅胶）上，然后与荧光标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息。

基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。 基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。

基因芯片或微阵列是近年发展起来的分子生物学研究工具。在 1 平方厘米的芯片上可以同时分析几百至数万个基因，具有高通量、快速获取有关生物学信息的特点。目前基因芯片主要用于科研，要从实验室研究推向临床应用还有一系列问题需要解决。如提高特异性、简化操作、降低成本等。

第三节 基因诊断的应用 一、遗传性疾病的诊断 二、感染性疾病基因诊断 三、基因诊断在法医学中的应用

一、遗传性疾病的诊断 镰状细胞贫血的基因诊断 血红蛋白(hemoglobin, Hb)

镰刀形红细胞贫血 （sickle cell anemia）

镰状细胞贫血的基因诊断 HbA:2053bp 点突变,发生在限制性内切酶位点上 CCTNAGG MstII MstII MstII 5 6 7 Pro Glu Glu HbA 0.2kb CCT GAG GAG 1.1kb Pro Val Glu MstII MstII HbS CCT GTG GAG 1.3kb

Southern blot 检测镰状细胞贫血 制备血液DNA MstII消化 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜 与标记的珠蛋白DNA杂交 放射自显影 PCR扩增检测 PCR扩增珠蛋白基因 琼脂糖电泳EB染色 MstII消化

镰状细胞贫血症患者的血样本DNA经MstII（识别序列CCTGAGG）酶切后电泳检测。 1.3Kb 1.1Kb 杂合子 纯合子

SS AA AS bp 294 191 103 PCR扩增检测结果

二、感染性疾病基因诊断 感染性疾病由病原微生物引起，致病的病原微生物主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等。这些病原体的传统检测方法通常采用形态学检查，体外培养和免疫学试验。但对某些难以培养的病原体，抗原抗体检测不能判断体内病原体 DNA 或 RNA的 复制情况，或存在检测灵敏度低等问题。自聚合酶链反应（ PCR ）技术问世以来，基因诊断技术作为病原体检测的新方法得到突飞猛进的发展

病原体基因诊断的主要技术方法 实时荧光定量 PCR （ Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ—PCR ）

实时荧光定量 PCR在常规 PCR 基础上，添加了一条标记 2 个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的 5‘ 端，称为荧光报告基团（ R ）；另一个标记在探针的 3’ 端，称为荧光抑制基团（ 淬灭基团 Q ）。探针的 3‘ 羟基（ -OH ）已被去除或封闭，不具有延伸能力。在探针分子完整的情况下， R 发出的荧光被 Q 淬灭吸收。此时检测不到荧光信号。当特异性 PCR 扩增发生时，探针会在 PCR 过程中被 Taq 酶的 5’--3‘外切酶 活性作用切断，释放出R基团, Q的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的产生,荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 。荧光信号伴随 PCR 产物的增长而增长目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝大部分是此类。

目前病原体基因诊断在临床上最大的用途是 1.检测难于培养的病原体 2.在治疗中检测病毒载量以评价疗效 3.治疗过程中检测耐药基因突变 4.用于血液筛查 5.用基因分型方法进行病原体种群分类。

已通过国家药品食品监督管理局（ SFDA ）审批的基因诊断试剂

序号 试剂盒名称 1 乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 2 乙肝病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒 序号 试剂盒名称 1 乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 2 乙肝病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒   丙肝病毒（HCV）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒 结核分支杆菌（TB）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒 沙眼衣原体（CT）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒 6 沙眼衣原体和淋球菌（CT&NG）核酸扩增（PCR）荧光检测试 剂盒 7 人乳头瘤病毒（HIV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒   8 人类免疫缺陷病毒（HIV—1）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒 9 新型冠状病毒（SARS）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒 10 神经管畸形基因检测（PCR—RFLP）试剂盒   11 地中海贫血基因检测试剂盒（基因芯片法)

拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象。使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为 15-32% 、 38% 、 49% 、 66% 。因此，服药前期及服药期间监测 YMDD 的变化及 HBV DNA 含量就显得十分重要。拉米夫定耐药的主要原因是病毒多聚酶基因的 YMDD （酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）区域发生突变，即由 YMDD 突变为 YIDD 或 YVDD ，从而产生耐药。蛋氨酸突变为异亮氨酸 Ⅰ或 缬 氨酸Ⅴ，从而降低了拉米夫定的亲和力，减弱拉米夫定对突变病毒复制的抑制能力

病原体基因诊断的发展趋势 1 、提高自动化程度。从标本预处理、核酸提取到基因扩增和产物检测都有望实现自动化，可将人为误差降到最小，提高检测的精确度，提高工作效率。 2 、测定方法和工作程序的标准化。通过标准化改善实验室测定准确度，从而提高不同实验室间结果的可比性。 3 、在严密设计的临床应用研究基础上，确定每一个基因诊断项目适用的范围，避免滥用造成的困扰和不必要的费用。 4 、开发更加快捷廉价的检测方法

三 、基因诊断在法医学中的应用 法医学中对生物样本检测的主要目的是达到个人识别和亲子鉴定 80年代以来，以核酸分子杂交和PCR技术为核心的基因诊断学的迅速发展，有逐渐取代传统法医物证鉴别法的趋势 法医学基因诊断的分子基础是基于人类基因组结构中存在一些可作为个体特征标示的序列,即可变串连重复序列（小卫星DNA ）的多态性

三.基因诊断在法医学中的应用 DNA指纹技术： 遗传基础是DNA的多态性 个体特征标志的序列 建立于1985年

3.3 billion bp with < 40000 genes 1.1%: exons; (Coding region) )) Human genome: 3.3 billion bp with < 40000 genes 1.1%: exons; (Coding region) )) 24% introns, 75% intergenic Noncoding

Genome: Coding region (编码区)： <5% in human genome (1.5%). 2. Noncoding (非编码) DNA: introns (内含子), tandemly repeated (串连重复) sequences (e.g. satellite DNA) or interspersed repeats 分散重复 (e.g. Alu element).

5’ – ATAAACTATAAACTATAAACT – 3’ 3’ – TATTTGATATTTGATATTTGA – 5’ n 可变串联重复序列（variable number of tantem repeat VNTR) (小卫星DNA) 小卫星DNA核心序列长10-70bp，主要分布于基因组的非编码区。不同个体重复次数相差悬殊，因而长度变化较大，呈现多态性。可以用来鉴别个体 5’ – ATAAACTATAAACTATAAACT – 3’ 3’ – TATTTGATATTTGATATTTGA – 5’ n （核心序列） Satellites comprise more than 40% of the genome

遗传基础是DNA的多态性 DNA指纹技术： 个体特征标志的序列 建立于1985年

方法: 指纹图谱法: 用HinfI切割染色体DNA.由于该酶在小卫星DNA的重复序列上无切点,因此电泳后在用标记的小卫星DNA做探针杂交时,不同个体出现不同的杂交带型,称为指纹图谱.至今世界上还未发现有两个人的杂交带型完全相同.

不同的个体或群体有不同的DNA指纹图:英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图的概率，为三千亿分之一(即3×10-11)。两个同胞个体具有相同图谱的概率也仅仅为二百万分之一(即2×10-6)。但同卵双胞胎的DNA指纹图完全相同。

DNA指纹术的工作原理及步骤 提取DNA (样品:毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等) 用限制性内切酶HinfI切割，将DNA切割成许多长度不同的小片段。 对酶解完全后的DNA片段进行电泳，分离各酶切片段。 先用碱性溶液使凝胶板中双链DNA片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA片段转印到尼龙膜上。 让放射性核心序列探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。 用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X 射线使胶片曝光，从而使杂交带显影在胶片上。 获得DNA片段条状图谱,便是所谓的DNA指纹。

DNA指纹技术的原理：P457 An application of repeated DNA sequences found in mammalian genomes Highly variable between individuals No two people are the same, except identical twins

DNA 指纹的特点 1 ．高度的特异性 2 ． 稳定的遗传性： DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现， DNA 指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递 50 ％ 给子代。 3 ． 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、 肌肉、毛发、精液等产生的 DNA 指纹图形完全一致。