第 二 章 微生物的纯培养和显微技术 主讲人：刘石泉

主要内容： 2.1 微生物分离和纯培养 2.2 显微镜和显微技术

纯培养物 混合培养物 是微生物研究的重要技术之一 培养物（culture）：在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体 纯培养物（pure culture）：只有一种微生物的培养物 培养物 纯培养物 混合培养物 纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一

个体小 显微技术是微生物研究的另一项重要技术

2.1.1 无菌技术 2.1.2. 用固体培养基分离纯培养 2.1.3. 用液体培养基分离纯培养 2.1.4. 单细胞（孢子）分离 2.1 微生物的分离和纯培养 2.1.1 无菌技术 2.1.2. 用固体培养基分离纯培养 2.1.3. 用液体培养基分离纯培养 2.1.4. 单细胞（孢子）分离 2.1.5. 选择培养分离 2.1.6. 二元培养物

2.1.1 无菌技术 A 微生物培养的常用器具 B 最常用灭菌方法 C 接种操作 无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术。 它是保证微生物学研究正常进行的关键 A 微生物培养的常用器具 B 最常用灭菌方法 C 接种操作

A 微生物培养的常用器具 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要灭菌 培养基：培养微生物营养物质。

A 微生物培养的常用器具 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒

B 最常用的灭菌方法 1. 干热灭菌：一般玻璃用具，如培养皿、吸管等用报纸包好后，放烘箱中，使温度逐渐升至150～160℃，保持2小时后，关闭电源，使缓慢冷却（降温太快时玻璃易碎），即灭菌完毕。

2. 湿热灭菌：利用蒸气杀菌。 ①常压法（间歇灭菌法）：是用蒸汽锅（或普通锅）蒸，温度不超过100℃。每次一小时，共三次，每次间隔24小时（杀死孢子）。 ②高压法：锅内增加压力时则温度随之增高。 温度为112.6℃；灭菌30分钟。 　温度为120～121℃；灭菌20分钟。

3. 过滤除菌法 本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。 除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的孔径一般不超过0.22μm。

4. 火焰灭菌： 对于接种针或其它金属用具灭菌，可直接在酒精灯火焰上烧至红热。此外在接种过程中，试管或三角瓶口，也采取通过火焰达到灭菌的目的。

5. 药物灭菌： ① 70％的酒精：操作前手或器皿的表面杀菌，载玻片，盖玻片的浸泡等。 ② 1:1000 新洁尔灭溶液，浸泡时间为30分钟，常用于表面的消毒。 ③ 福尔马林（40％甲醛液）：用于空间熏蒸灭菌，加热或加高锰酸钾使其放出甲醛气体。注意将空间密闭并维持24小时。

6. 紫外线灭菌 用于接种室等空气灭菌。

常用的灭菌器具 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒

C 接种操作—最基本技术 用接种针或接种环分离微生物，或将微生物从一个培养器皿转接到另一个培养器皿进行培养。火焰旁边或无菌箱或无菌室进行。 接种针采用可以迅速加热和冷却的镍铬合金制备； 液体培养物用无菌移液管或移液器

超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 无菌操作台 火焰旁无菌区

2.1.2 用固体培养基分离纯培养 A 相关概念1——菌落与菌苔 菌落（colony） ：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔(lawn)：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。

菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。

                                          细菌菌落 菌落的形态是鉴定菌种的重要特征

放线菌菌落 放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落。

酵母菌落

大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。 A 相关概念2——纯种微生物的分离 在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的，要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离 大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。

A 相关概念3——培养平板（culture plate） 克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一个纯种细胞群或克隆。 固体培养基：琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。 平板：即培养平板（culture plate), 融化的固体 培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板， 用于分离、培养微生物。

B 纯种微生物的分离方法 稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法

1 稀释倒平板法 稀释：先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......）； 倒平板：然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板； 培养：保温培养一定时间即可出现菌落。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。　

2. 涂布平板法 先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板； 将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面； 经培养后挑取单个菌落； 稀释倒平板法因为细菌与50℃培养基混合导致某些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法。

3. 平板划线法 接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。 平板划线分离

4. 稀释摇管法(dilution shake culture method） 厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。 操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50℃， 待分离材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口

厌氧微生物分离装置： 厌氧罐 厌氧手套箱

2.1.3 用液体培养基分离纯培养 一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，需要用液体培养基分离来获得纯培养。 接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（>95％）没有，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。

2.1.4 单细胞分离 单细胞（单孢子）显微分离 显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养 稀释法缺点 分离优势菌 显微操作仪，专业程度高

2.1.5 选择培养分离 A 利用选择培养基直接分离 对某微生物生长需要了解后，根据微生物的特性设计培养基，即使该微生物在混杂群体中很少也可分离。 如：耐高温菌采用高温筛选； 蛋白酶产生菌加牛奶或酪素筛选； 抗抗生素可采用加抗生素筛选

土悬液—以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基——分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。 2 富集培养 土悬液—培养基+硫磺—分离出硫杆菌 土悬液—以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基——分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。 特定的环境条件 仅适应于该条件的微生物旺盛生长 待分离微生物在群落中的数量大大增加 从自然界中分离到所需的特定微生物

2.1.6 二元培养物 纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。 二元培养物: 培养物只含两种微生物，并有意识保持两者之间 的特定关系的培养物为二元培养物。 例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。对于病毒来说，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。

2.1.7 微生物的保藏技术 菌种保藏目的：给微生物一特定的条件，使其不污染、不改变特性而存活下来。 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 菌种保藏原理：用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。 要求：菌种不死，不污染，不变

传代培养保藏——隔绝空气低温保藏 冷冻保藏——保护剂+菌种——零下196度速冻保存，或-70度冷冻室保存，-20~-30度普通冰箱冷冻室保存。 干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥保藏法

2.2 显微镜和显微技术 决定显微观察效果的两个重要因素 分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力 反差：指样品区别于背景的程度

2.2 显微镜和显微技术 2.2.1. 显微镜的种类及原理 2.2.2. 显微观察样品的制备

2.2.1 显微镜的种类及原理 普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜

1. 普通光学显微镜 普通显微镜 机械装置：镜座、支架、载物台、调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光器 普通显微镜结构示意图

显微镜的分辨率与放大倍数 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 D = 0.61λ/ N．A = 0.61λ/ｎsinα/2 ． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？

显微镜的几个光学特点 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

2.暗视野显微镜 利用特殊聚光器实现给样品斜射照明，由样品反射或折射的光再进入物镜，这样整个视野是暗的，只有样品是明亮的。 主要用于观察生活细菌的运动性。

3. 相差显微镜 光线透过透明标本，波长（颜色）和振幅（亮度）没有多大变化，用普通显微镜观察透明标本，其形态和内部结构难以分辨。细胞各部分折射率和厚度不同，当光线通过时，直射光和衍射光光程有差别，而人眼看不到，但是可通过相差显微镜看到。 相差显微镜采用特殊光学装置：环状光阑和相差板，利用光的干涉，将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。 其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。

4. 荧光显微镜 荧光显微技术原理：荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体。在免疫学和分子生物学应用广泛。

5. 透射电子显微镜（简写TEM） 用波长短的电磁波取代可见光，使分辨率提高。 工作原理类似，因光源不同，有区别: 1）电子遇空气中分子会发生偏转使物象不清楚，因此镜筒高真空； 2)电子带电荷，电镜是用电磁圈使之聚焦 ； 3)电子像人眼看不到，用荧光屏显示或感光胶片记录。

6. 扫描电子显微镜（SEM） 大肠杆菌扫描电镜图 扫描电子显微镜 工作原理与光学显微镜和透射电子显微镜不同，是电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。 主要用于：样品表面结构

7. 扫描隧道显微镜（STM） 80年代出现的，原理：利用量子力学中的隧道效应。 其横向分辨率：0.1～0.2nm，纵向分辨率：0.001nm 这种分辨率足以对单个原子观察。 用这种显微镜可直接观察蛋白质、DNA、RNA等分子的结构。

厨房抹布上的细菌和霉菌 扫描隧道显微镜下的DNA 棉纤维上的汗垢

考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。 2.2.2 显微镜和显微技术 样品好坏直接影响观察结果。 考虑因素：根据所用显微镜特点采用合适制样方法，尽可能使样品生理结构稳定，采用各种方法提高反差。

压滴法 活体观察 悬滴法 菌丝埋片法 染色 死菌 活菌 鉴别染色 简单染色 美蓝染色 光学显微镜制样 染色 死菌 活菌 鉴别染色 简单染色 美蓝染色 革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色

光学显微镜样品制备－－活体观察 特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察 。 压滴法：菌悬液滴载玻片，加盖玻片直接观察； 悬滴法：盖玻片滴一滴菌悬液，反转置于特制凹载玻片直接观察 ； 菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬液，培养后，取下玻璃纸置于载玻片，观察 。

光学显微样品制备－－染色观察 活体观察难看到微生物的细致形态和结构，需染色观察。染色前需要对样品固定，目的：杀死细菌使菌体黏附在玻片上；还可增加对染料的亲和力。 常用方法：酒精火焰加热和化学固定（ 95%酒精、酒精和醚各半的混合物、丙酮、1—2%的锇酸等）

革兰氏染色过程 革兰氏染色法 ·革兰氏染色法：1884年，由丹麦病理学家革兰创造并使用的一种能鉴别细菌的染色方法。 甲菌 乙菌 结晶紫 初染 碘液 媒染 95%酒精 脱色 番红 复染 紫色 红色 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 革兰氏染色过程

枯草杆菌革兰氏染色 大肠杆菌革兰氏染色

电镜制样 样品观察前要固定和干燥，一般要重金属盐染色或喷镀，提高反差，使电子图像清晰。

透射电镜制样 覆盖有支持网的载网（一般为铜网、不锈钢、金、银等） 负染技术：电子密度高、本身不显示结构、与样品几乎不反应的物质，如：磷钨酸钠进行染色。 重金属盐不被样品吸附沉积在四周，若样品具有表面结构，重金属盐就进入表面凹陷部分，通过散射电子能力差异把样品外形和表面结构衬托出来。 负染技术简便易行，病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸可用此方法观察。

透射电镜制样 投影技术： 真空蒸发设备将铂或铬等对电子散射能力强的金属原子，由样品斜上方喷镀，提高样品反差。可用于病毒、细菌鞭毛、离体细胞器、蛋白质和核酸等观察。 超薄切片技术： 微生物个体虽小，微弱电子束无法透过整体标本，需制成100纳米以下的超薄切片才能看清内部细微结构。基本操作过程：取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察。

浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。

负染色技术和投影技术

本章思考题： 1. 简述干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌法原理和方法 2. 简述超净工作台的工作原理 3. 简述稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线分离法操作方法 4. 为什么稀释摇管法适合培养分离厌氧微生物？试设计一种厌氧微生物分离装置，并简述其原理 5. 简述选择培养基直接分离和富集培养分离微生物的原理和步骤 6. 什么是二元培养物，在微生物的保存上有何意义 7. 简述几种常见菌种保藏方法和原理

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