第 八 章 　 发 酵 工 程

传统发酵已有相当长的历史，春秋时代的孔子已经借酒助兴了。传统发酵技术工业化不过是发酵使用的设备的更新带来了规模的扩大。只有在生物工程到来之后，发酵工业开始采用工程菌，使得通过发酵获得的产品一改过去以酒和调味品为代表的旧貌，开始了以生物制药为代表的大飞跃。 1857年，法国微生物学家巴斯德发现了发酵原理，人们才认识到发酵是微生物活动的结果。此后，随着纯种微生物的分离及培养技术的建立，以及密闭式发酵罐的设计成功，使人们能够利用某种类型的微生物，在人工控制的环境条件下，进行大规模的生产，逐步形成了发酵工程。 生物工程的最终阶段是发酵。不仅是来自微生物，而且来自动物和植物细胞合成的物质都可以通过发酵来生产。农牧业工厂化的趋势之一是逐步转向发酵。 发酵生产周期短，容易调控。

1、发酵工程的概念和内容 （1）概念 发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。 发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等

（2）应用发酵工程的生产实例 谷氨酸是鲜味剂味精的主要成分，以前用植物(如大豆)蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。 常用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。培养基通常用豆饼(或马铃薯等)的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成，呈液体状态，因此也称培养液。其中的生物素是生长因子。培养液配制完成以后，投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，冷却后，在无菌条件下加入菌种，即为接种。 发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升不等，上面连接有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置；此外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置(如图)。

谷氨酸棒状杆菌是好氧菌，因此，发酵过程要不断地通入无菌空气，并通过搅拌，使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中(称溶氧)；同时，也能使菌种与培养液充分接触，提高它们对原料的利用率。 在温度为30～37℃、pH为7～8.0的条件下，经28～32h，培养液中就会生成大量的谷氨酸。 最后，将谷氨酸从培养液中分离提取出来，通常每升培养液中能得到谷氨酸50～100g。提取出来的谷氨酸用适量的Na2CO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤，便制成了味精。

（3）发酵的类型 按照是否需氧，发酵分为好氧和厌氧两大类，是否需氧是由所使用的细胞或菌株的代谢特性决定的。 好氧发酵 (aerobic fermentation) 发酵过程需要氧气。多数有机酸，如醋酸、柠檬酸和各种氨基酸的发酵生产菌需要氧气。发酵所需的氧气是以无菌空气方式供给的。不断搅拌促进氧气进入发酵液。 厌氧发酵(anaerobic fermentation)发酵过程无需氧气，不搅拌。酵母菌酿酒，乳酸菌生产乳酸，瘤胃细菌分解纤维素过程不需要氧气。 按照使用的细胞类型，发酵分为： 微生物发酵： 植物细胞发酵； 动物细胞发酵。 动植物细胞的发酵历史很短。通常所说的发酵主要是指微生物发酵。

（4）发酵的意义 1.获得用其它方法不易获得的物质 酒精等有机物质，生物碱、激素、酶、蛋白质、核酸、复杂的多糖等物质至今要靠发酵来获得。化学合成的成本太高，有些物质目前还不能化学方法合成，例如有旋光活性的氨基酸，D、L型的挑选要用酶的立体专一性解决。用化学方法生产酶至少现在几乎不可思议。 2.获得菌体 有些微生物菌体，如人体所需的双歧乳酸菌，是以活的菌体为需要对象。 3.转化为用其它方法不能或不易转化的物质 自然界第一位的材料是纤维素。目前纤维素的分解主要靠生物分解。牛、羊瘤胃中细菌分解纤维素的能力是化学方法无法相比的，这样的转化产物是乳汁且无污染，而化学方法最多的转化产物是纸以及造纸所产生的大量有污染的废水。

2、发酵工程的工艺流程 发酵生产的设备 发酵罐又叫反应器，有通风和嫌气两类。前者用于好氧发酵，后者用于厌氧发酵。也有同时适合于两种类型的发酵罐。 物料处理和运输设备 如磨碎机、筛选机、输送机等，用于将原料粉碎和传输至发酵罐。 空气调节和除菌设备 调节空气的湿度、温度和除去空气中的微生物。 过滤与分离设备 如过滤机，离心机等用于发酵成熟液的过滤、澄清；产物的分离。 浓缩干燥结晶设备 用于分离后获得的初品的再处理。

发酵设备及检测控制系统  B|Braun公司 发酵罐：Biostat系列 参数检测 多级控制： 人工 DCU MFCS

Biostat B2 Biostat ED10

Pilot Biostat UD50

MFCS

发酵的工艺控制 发酵过程需在以下方面监控，这些指标已经实现在线自动化。 1. 温度 升、降温度是通过发酵罐的夹套或换热蛇管（排管）中的蒸汽或制冷剂，与发酵液进行热交换实现的。 2.溶氧 通风搅拌增加溶解氧 3.pH 调节方法为加酸、碱或稀释。 以上三项使用传感器监控。 4.泡沫 发酵过程产生过多泡沫会影响发酵正常进行，加入消泡剂可以减少泡沫生成。 5.中间产物 要使微生物和动植物细胞的代谢朝着所需的方向进行，应用细胞代谢调控知识引导，否则会出现过多的副产物。 6.杂菌污染 非发酵使用的微生物会随时进入发酵罐。确保菌种扩大期间无杂菌培养是最关键的一步。发酵期间杂菌污染要及时发现和消除。

3、发酵工程的应用 1、在食品工业上的应用 （1）通过发酵工程使一些传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，在产量和质量上得到明显的提高。 　（1）通过发酵工程使一些传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，在产量和质量上得到明显的提高。 （2）通过发酵工程生产食品添加剂（见下表），改善了食品的品质及色、香、味。　 常用的几类食品添加剂 添加剂 举例 酸味剂 L-苹果酸、柠檬酸、乳酸 鲜味剂 肌苷酸、谷氨酸 色素 β-胡萝卜素、红曲素 甜味剂 高果糖浆、甜菜糖

（3）发酵工程有望为解决人类的粮食短缺问题开辟一条新的途径。 　　微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%～80%，酵母菌的占45%～65%，而且它们的生长繁殖速度很快。因此，许多国家利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液、石化产品等为原料，通过发酵获得大量的微生物菌体，这种生物菌体就叫做单细胞蛋白。20世纪80年代中期，全世界生产的单细胞蛋白已达2×106吨。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可作为食品添加剂，甚至制成“人造肉”供人们直接食用。最近国外市场上出现的一种真菌蛋白食品，就以其高蛋白、低脂肪的特点受到了消费者的欢迎。单细胞蛋白用做饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。

2、在医药工业上的应用 发酵工程已广泛应用于医药工业，很多抗生素、维生素、动物激素、药用氨基酸、核苷酸等都可通过发酵工程得到，其中，抗生素的生产占主要地位。20世纪80年代，世界各地的抗生素年产量达2.5×104吨，产值超过40亿美元。目前，常用的抗生素已达一百多种，如青霉素类、头孢菌素类、红霉素类和四环素类。 有些药物如人生长激素、胰岛素，过去主要是靠从生物体器官、组织、细胞或尿液中提取，发酵工程使这些药物的生产量大大提高，已可满足普通人的需要。 　随着基因工程和发酵工程的结合应用，人们已可大批量生产人生长激素、重组乙肝疫苗、某些种类的单克隆抗体、白细胞介素、抗血友病因子、生长激素释放抑制因子等重要的药物。

抗生素的生产过程 测定抗菌能力　 接种 　　 　酵产品的提纯

发酵工程 发酵工程的产品范围非常广泛。 从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料等等及生物可降解塑料PHB等。

例：生物可降解塑料PHB（聚羟基烷酸）的生产

2000年的中国包装材料工业 总耗材24万吨 玻璃 纸 金属 塑料 来源: 中国降解塑料通讯 23: 1-7 (1999)

中国包装材料工业的发展 看来中国的塑料污染问题将继续严重!!! 在美国、日本和许多发达国家，塑料消耗量超过 每人 每年100 公斤 而08年前中国，塑料消耗量只有每人每年12 公斤 看来中国的塑料污染问题将继续严重!!!

如何解决日益增加的塑料污染问题？

解决方法： 分离和重复利用？ 减少塑料用量，包括焚烧？ 用纸代替塑料，或用光降解材料代替塑料？ 生物可降解的材料？？

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) Characteristic Mostly hydrophobic(疏水的) Chiral（手性的） monomers Great structure variety Among PHA, polyhydroxybutyrate(聚羟基丁酸，PHB) is the most common Molecular weights range from 10,000 to several millions

Project PHB Phase1 Strain selections: Samples collection from islands, mountains, forests and oil plants

A Bacillus Strain with Industrial Potential Project PHB Phase 2: Lab Process Devlopemnt A Bacillus Strain with Industrial Potential Shake Flask Results: 11g/l of cell dry weight containing 70% of PHB after 48 hrs growth in molasses（蜜糖） only medium Fermentor Results: 30 g/l of cell dry weight with 78% of PHB accumulation after 8 hrs of growth in a 5 L fermentor

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopemnt PHB Pilot Production Process （4 cubic meter fermentor) Petri Disk PHB dryer Centrifuge Shake Flask 4 m3 Fermentor PHB Extraction dryer Order（定货单） has been received from Germany. PHB powder

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopemnt PHB Pilot Production Process （4 cubic meter fermentor) Molasses was treated to remove sediments（沉淀物） Fermentation was carried out in a 4 m3 vessel

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopemnt PHB Pilot Fermentation Process （4 cubic meter fermentor) 800 L Seed fermentor 4000 L Pilot fermentor

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopemnt PHB Pilot Production Process （Separation process) The bacterial cells will be harvested by continuous centrifugation (Westfalia Disc-Centrifuge, 40 tons/h) The concentrated cells will be transferred to a container for PHB extraction

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopment PHB Pilot Production Process （PHB extraction process) Concentrated cells were lysed using SDS at 50oC and pH 10-11 The PHB granules were centrifuged and washed. The washed PHB granules suspensions were treated with protease and Na-hyperchloride to increase PHB purity.

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopment （PHB extraction process) The PHB granules were be further purified with protease and Na-NaOCl to whiten the product.

Project PHB Phase 3: Pilot Process Devlopment （PHB drying process) Spread dry the PHB granules suspension to obtain the PHB in final powder form. Dried cell mass Dried PHB

PHB Genetic Engineering phbA phbB phbC PHB genes Plasmid Insert PHB genes into a vector Transform a vector into E. coli E. coli cell

PHB genes have been expressed in Plant

Future Plastic