动物性食品微生物检验 金黄色葡萄球菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 理解葡萄球菌的生物学特性。 了解金黄色葡萄球菌的致病性。 掌握金黄色葡萄球菌标准检验方法。 会制备金黄色葡萄球菌检验用培养基。 会对金黄色葡萄球菌进行检验。

主要内容 金黄色葡萄球菌的生物学特性 金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌的检验方法 金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌的污染的控制

一、生物学特性 形态及染色特性：典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。

典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。

金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片

培养特性：金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7 培养特性：金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长，故可用高盐培养基分离金黄色葡萄球菌。

在普通琼脂平板：光滑、湿润、隆起的边缘整齐、不透明的圆形菌落，直径1～2mm，也有的达3～4mm，在有氧环境中可产生色素，在无氧环境中不产生色素。

在血琼脂平板：形成较大的菌落，多数菌株能产生溶血素而使菌落周围出现β溶血环。非致病性菌则无此现象。 补充： 溶血现象α溶血——草绿色溶血 不完全溶血β溶血——菌落周围形成明显的全透明溶血环 γ溶血——不溶血。

Baird-parker氏琼脂平板：圆形、光滑、凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色、边缘为淡色，周围为一混浊带并在其外层有一透明带。

生化特性： 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。 甲基红反应阳性，V-P反应阴性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

抗原特性：葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成分，即蛋白质抗原和多糖类抗原。 蛋白质抗原：主要为葡萄球菌 A蛋白（简称SPA），是一种表面抗原，从人分离到的菌株均有SPA，来自动物的少见。 多糖类抗原：为存在于细胞壁上的半抗原，是该菌的一个重要抗原，有型特异性。此抗原可用于此菌的分型。

金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型（简介） 血清学分型：金葡水解，获得两种抗原成分 蛋白抗原：主要为葡萄球菌A蛋白（SPA）是凝集抗原，无特异性。 多糖抗原：有特异性。 噬菌体分型 根据肠毒素分型 根据血浆凝固酶分型

二、金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌致病的特点是化脓性炎症，由于侵入途径、菌量、毒力以及机体免疫力不同，引起疾病的种类和程度各不相同。感染后可出现毛囊炎、疖、痈至败血病等，造成肠道菌群失调后又可引起肠炎，产生肠毒素的菌株能引起食物中毒。

致病因子 溶血素 α溶血素：在37℃能溶解家兔红细胞，绵羊红细胞次之，不溶解人红细胞。在兔、绵羊血平板上形成较大透明溶血环。对人有致病性的葡萄球菌多产生α溶血素，其毒素作用为损伤血小板，能使局部小血管收缩，导致局部缺血和坏死，同时α溶血素造成细胞中毒时，可造成细胞代谢失调。如ATP增高，葡萄糖利用和乳酸产生下降。 β溶血素：β溶血素只溶解绵羊或牛红细胞，不溶解家兔和人红细胞，在绵羊血平板上生长形成大而不完全溶血的环，4℃过夜则完全溶血，此为冷热溶血现象。对动物有致病力的葡萄球菌多产生此类毒素。

致病因子 γ溶血素：能引起多种动物细胞发生溶解，与α溶血素相类似，但抗原性不同，对小白鼠有致死性。 δ溶血素：δ溶血素能溶解多种动物红细胞，为一种磷脂酶和皮肤坏死毒素。在CO2环境中它能溶解家兔、绵羊、人三种红细胞，在血平板上形成狭窄透明溶血环；对人或动物有致病性的葡萄球菌有些产生此型毒素。 ε溶血素：一般产生于凝固酶阴性的表皮葡萄球菌中。

致病因子 肠毒素：金黄色葡萄球菌的某些溶血菌株能产生一种引起急性胃肠炎的肠毒素，此种菌株污染牛奶、肉类、鱼虾、糕点等食物后，在室温（20℃以上）下经8~10小时能产生大量毒素，人摄食该菌污染的食物2~3小时后引起中毒症状。 目前，发现肠毒素有A、B、C1、C2、D、E、F等型。6型肠毒素具有不同的血清学特性，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之，肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热，100℃煮沸30分钟不被破坏，对胰蛋白酶有抵抗力；可致人、猫、猴急性胃肠炎症状，食物中毒病人的标本，可用幼猫经口服测定肠毒素的存在。

致病因子 杀白细胞素：大多数致病性葡萄球菌能产生杀白细胞素，它能破坏人或兔的粒细胞，主要是作用于细胞膜，使细胞的代谢发生变化而破坏，可使粒细胞脱粒成周围带有颗粒的空泡，具有抗原性、不耐热，能通过细菌滤器。杀白细胞素的抗体能阻止葡萄球菌感染的复发。

致病因子 血浆凝固酶：是一种能使经过枸橼酸钠或肝素抗凝的家兔或人的血浆凝固的酶。多数致病性葡萄球菌能产生此酶，而非致病性菌不产生此酶。

金黄色葡萄球菌引起的下颚感染 黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌， 可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

金黄色葡萄球菌引起的须疮感染 黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌， 可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 肠毒素形成条件： 存放温度，在37℃内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。

三、金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。

金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。

一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。

四、检验 以《食品安全国家标准 食品微生物学检验》中金黄色葡萄球菌检验方法 GB4789.10-2010进行。

金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 金黄色葡萄球菌检验方法 1 2 3 金黄色葡萄球菌定性检验 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 金黄色葡萄球菌MPN计数

金黄色葡萄球菌定性检验 样品处理 增菌 分离培养 鉴定 肠毒素试验 结果 报告

1．样品的处理 固态样品：25g样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min 均质1min～2min，或放入无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2min。 液态样品：吸取25mL样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 )中，振荡混匀。

2 ．增菌 培养：将上述样品匀液于36℃±1℃，18h～24h。 观察结果：金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

3 ．分离培养 将增菌培养物，分别划线接种到 Baird-Parker平板 培养：36℃±1℃，18h～24h 或 45h～48h。 血平板

金黄色葡萄球菌在Baird-parker菌落特征 典型菌落：圆形、光滑、凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色、边缘为淡色，周围为一混浊带并在其外层有一透明带。 不典型菌落：颜色呈灰色到黑色,无浑浊带及透明圈。

金黄色葡萄球菌在血平板菌落特征 典型菌落：形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

4 ．鉴定-染色镜检 革兰氏染色：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5mm～1mm。

4 ．鉴定-血浆凝固酶试验 试验方法： 接种：挑取分离培养平板上的可疑菌落，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面。 培养：36℃±1℃ 18h～24h。 金黄色葡萄球菌在斜面生长情况

金黄色葡萄球菌在BHI生长情况 生长情况：该菌在肉汤培养基中生长迅速，经37℃18～24小时，呈均匀混浊，并有部分细菌沉淀管底，摇动易散。

加样：取新鲜配置兔血浆 0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物 0.2mL～0.3mL，振荡摇匀。 对照：同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 其它方法：也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

结果判定：如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。

5 ．葡萄球菌肠毒素检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按国标检测葡萄球菌肠毒素。 检测方法： 动物学试验：主要用幼猫和猴。 血清学试验：肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有： 免疫琼脂扩散法、反向间接血凝试验、免疫荧光法、酶联免疫吸附法

6 ．结果与报告 结果判定：符合上述鉴定条件，可判定为金黄色葡萄球菌。 结果报告：在 25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

五、金黄色葡萄球菌快速检测方法（简介） 目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。 比如：法国梅里埃公司生产的RPF试剂盒、API检测系统等。梅里埃公司生产的miniVIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上45分钟可以得到结果。

法国梅里埃公司生产的RPF培养基：将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段 凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈

美国3M公司生产的金黄色葡萄球菌快速检测试片，可以直接计数产生耐热核酸酶的金黄色葡萄球菌，操作简单，缩短了时间。

金黄色葡萄球菌在海博金黄色葡萄球菌显色培养基上典型特征

六、金黄色葡萄球菌污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染的人员要暂时停止其工作或调换岗位。 防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。

对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成 应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。

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