实验二 植物基因组DNA的提取
一. 实验目的及背景 高等动物,高等植物的基因组相当宠大, 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成,果蝇基因组有1.4*108个碱基对,水稻基因组有1.4*109个碱基对。真核细胞基因组中,约1-1.5万个可表达的结构基因,其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组,包含了该物种生长,发育,繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量,因而对真核细胞基因组的结构,组成,以及表达调控的研究是至关重要的。而研究的起点就是要获得纯度高(不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染);得率好(以便有足够量用于分析);基因组相对完整的基因组(无断裂、降解)以便用于以后PCR分析、基因文库的构建、基因探针等的研究。
二、实验原理 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步,首先是机械法破细胞抽提;然后去除蛋白质,糖类等细胞内杂质污染;最后纯化出DNA,由于真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
二、实验原理 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
三、实验材料 水稻叶片 四、主要试剂 2×CTAB,氯仿,100%无水乙醇,75%乙醇,异丙醇等
五、实验步骤 (微量提取) 1 、将叶片置于研钵中,用液氮研磨至粉状 2 、取少量粉末至1.5 ml离心管中(约至0.25ml刻度处) 3 、加入600 µl 2 ×CTAB试剂,轻轻摇动混匀 4 、置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10 min轻轻摇动,40 min后取出 5、冷却1 min后,加入600µl氯仿,剧烈振荡混匀 6、放入台式离心机中12 000 rpm离心5 min 7、取400 µl上清液移入一新的1.5ml离心管中,加入3/4体积的异丙醇, 缓慢颠倒混匀,出现的白色絮状物即为基因组DNA 8、放入台式离心机中12 000 rpm离心5 min,去上清(注意勿将DNA沉淀倒出) 9、加入300 µl 75%乙醇轻轻洗涤管壁 10 、放入台式离心机中12 000 rpm离心21min,去上清(注意勿将DNA沉淀倒出) 11 、将离心管倒立于铺开的纸巾上,去乙醇,风干 12、用50 µl TE或双蒸水溶解沉淀DNA,电泳(0.8%)检测,余下的保存于-20℃
六、实验结果
七、 注意事项 (1)叶片磨得越细越好。 (2)移液器的使用。 (3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提 液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅 速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶, 使DNA降解。
八、思考题 1、本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇 2、提取基因组DNA的方法有哪些?各有何优缺点?